| 缩略词表 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-25页 |
| ·溶菌酶简介 | 第13页 |
| ·i-型溶菌酶研究进展 | 第13-18页 |
| ·i-型溶菌酶的发现 | 第13-14页 |
| ·i-型溶菌酶催化机制的结构基础 | 第14-17页 |
| ·i-型溶菌酶的晶体结构 | 第14-15页 |
| ·i-型溶菌酶的催化机制 | 第15-17页 |
| ·i-型溶菌酶的多功能活性 | 第17-18页 |
| ·胞壁质酶/几丁质酶活性 | 第17页 |
| ·异构肽酶活性 | 第17页 |
| ·非酶抑菌活性 | 第17-18页 |
| ·溶菌酶的应用 | 第18页 |
| ·溶菌酶的研究现状及前景 | 第18-19页 |
| ·酿酒酵母表达系统概述 | 第19-22页 |
| ·酿酒酵母简介 | 第19-20页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第20-21页 |
| ·表达宿主 | 第20页 |
| ·表达载体 | 第20页 |
| ·表达载体主要构件 | 第20-21页 |
| ·酿酒酵母表达系统的优缺点 | 第21页 |
| ·外源基因在酿酒酵母中的高效表达 | 第21-22页 |
| ·研究内容、目的、意义和技术路线 | 第22-25页 |
| ·研究内容 | 第22页 |
| ·研究目的和意义 | 第22-23页 |
| ·研究的技术路线 | 第23-25页 |
| ·海参溶菌酶胞内表达技术路线 | 第23-24页 |
| ·海参溶菌酶胞外分泌表达技术路线 | 第24-25页 |
| 第二章 海参溶菌酶在酿酒酵母胞内表达系统的构建及分析 | 第25-58页 |
| ·材料与仪器 | 第25-30页 |
| ·菌种与质粒 | 第25页 |
| ·试剂与工具酶 | 第25-26页 |
| ·特异性引物 | 第26页 |
| ·主要实验仪器 | 第26-27页 |
| ·主要溶液及缓冲液 | 第27-29页 |
| ·抗生素溶液 | 第27页 |
| ·酿酒酵母培养所需溶液 | 第27页 |
| ·醋酸锂转化所需溶液 | 第27-28页 |
| ·western blot检测蛋白所需溶液 | 第28-29页 |
| ·实验用培养基 | 第29-30页 |
| ·LB液体、固体培养基 | 第29页 |
| ·YPDA液体、固体培养基 | 第29-30页 |
| ·SD-Leu+/SD-Leu-液体、固体培养基 | 第30页 |
| ·SG-Leu-液体培养基 | 第30页 |
| ·抗性培养基 | 第30页 |
| ·方法 | 第30-43页 |
| ·His6-SjLys基因扩增与重组克隆 | 第30-34页 |
| ·设计特异性引物 | 第30-31页 |
| ·PCR扩增His6-SjLys基因 | 第31页 |
| ·PCR产物的低熔点琼脂糖凝胶电泳回收 | 第31页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第31-32页 |
| ·重组质粒转化E. coli DH5α | 第32页 |
| ·重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的提取 | 第33页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第34页 |
| ·SjLys基因序列的密码子优化 | 第34-36页 |
| ·酿酒酵母密码子偏好性分析 | 第34页 |
| ·设计SjLys基因定点突变的特异性引物 | 第34-35页 |
| ·PCR扩增SjLys基因片段 | 第35-36页 |
| ·构建酿酒酵母重组胞内表达载体 | 第36-37页 |
| ·酶切与回收 | 第36-37页 |
| ·载体与目的片段的连接和转化 | 第37页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第37页 |
| ·重组表达质粒转化酿酒酵母MKP-0 及鉴定 | 第37-39页 |
| ·酿酒酵母MKP-0 感受态细胞的制备 | 第37-38页 |
| ·醋酸锂法转化MKP-0 | 第38页 |
| ·转化子的鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组SjLys蛋白的诱导表达 | 第39页 |
| ·western blot检测重组SjLys蛋白 | 第39-42页 |
| ·样品制备 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第39-41页 |
| ·转膜 | 第41页 |
| ·封闭 | 第41页 |
| ·抗体孵育 | 第41-42页 |
| ·显影检测 | 第42页 |
| ·重组SjLys蛋白表达的诱导时间优化及western blot检测 | 第42页 |
| ·重组SjLys蛋白的抑菌活性分析 | 第42-43页 |
| ·牛津杯法检测重组SjLys蛋白的抑菌活性 | 第42-43页 |
| ·扫描电子显微镜（SEM）法检测重组SjLys蛋白的抑菌活性 | 第43页 |
| ·结果与分析 | 第43-56页 |
| ·海参His6-SjLys基因的扩增、克隆质粒的构建 | 第43-46页 |
| ·海参His6-SjLys基因的扩增 | 第43-44页 |
| ·重组克隆质粒pMD18-T-His6-SjLys的构建 | 第44-46页 |
| ·SjLys基因序列的密码子优化 | 第46-49页 |
| ·酿酒酵母密码子偏好性分析 | 第46-48页 |
| ·SjLys基因的PCR扩增 | 第48页 |
| ·SjLys基因点突变的测序鉴定 | 第48-49页 |
| ·重组胞内表达载体的构建 | 第49-52页 |
| ·重组表达质粒的阳性转化子筛选及鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组SjLys蛋白的western blot检测 | 第53-55页 |
| ·重组SjLys蛋白诱导 60 h时的western blot检测 | 第53-54页 |
| ·重组SjLys蛋白诱导不同时间的western blot检测 | 第54-55页 |
| ·重组SjLys蛋白的抑菌活性分析 | 第55-56页 |
| ·重组SjLys蛋白抑菌活性的牛津杯法检测 | 第55页 |
| ·重组SjLys蛋白抑菌活性的扫描电子显微镜（SEM）法检测 | 第55-56页 |
| ·酿酒酵母中海参溶菌酶胞内其余表达系统/载体的构建 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-58页 |
| 第三章 海参溶菌酶在酿酒酵母胞外分泌表达系统的构建 | 第58-70页 |
| ·材料与仪器 | 第58-60页 |
| ·菌种与质粒 | 第58页 |
| ·试剂与工具酶 | 第58页 |
| ·特异性引物 | 第58页 |
| ·主要实验仪器 | 第58-59页 |
| ·主要溶液及缓冲液 | 第59页 |
| ·实验用培养基 | 第59-60页 |
| ·方法 | 第60-64页 |
| ·MFα1 基因扩增与重组克隆 | 第60-61页 |
| ·设计特异性引物 | 第60页 |
| ·PCR扩增MFα1 基因及产物回收 | 第60页 |
| ·目的片段与载体的连接及转化 | 第60-61页 |
| ·重组质粒的菌落PCR鉴定 | 第61页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第61页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第61页 |
| ·构建酿酒酵母重组胞外分泌表达载体 | 第61-63页 |
| ·pMD18-T-MFα1 和表达载体pESC-LEU-His6-SjLys(?69,77,95)的酶切与回收 | 第61-62页 |
| ·载体与目的片段的连接和转化 | 第62-63页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第63页 |
| ·重组表达质粒转化酿酒酵母MKP-0 及鉴定 | 第63-64页 |
| ·醋酸锂转化MKP-0 | 第63-64页 |
| ·转化子的鉴定 | 第64页 |
| ·结果与分析 | 第64-69页 |
| ·酿酒酵母信号肽的选择 | 第64页 |
| ·MFα1 信号肽基因的扩增、克隆质粒的构建 | 第64-66页 |
| ·MFα1 信号肽基因的扩增 | 第64-65页 |
| ·重组克隆质粒pMD18-T-MFα1 的构建 | 第65-66页 |
| ·重组胞外分泌表达载体的构建 | 第66-68页 |
| ·重组表达质粒的转化及阳性转化子的筛选、鉴定 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 第四章 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 附录 A p MD18-T Vector 图谱及序列 | 第76-77页 |
| 附录 B p ESC-LEU Vector 图谱及序列 | 第77-78页 |
| 附录 C p PIC9K Vector 图谱及序列 | 第78页 |
