| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-12页 |
| 符号、英文缩略对照表 | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-28页 |
| 综述一 口蹄疫病毒分子生物学研究进展 | 第16-19页 |
| 1 口蹄疫概述 | 第16-17页 |
| ·口蹄疫病的临场症状 | 第16-17页 |
| ·口蹄疫病流行现状 | 第17页 |
| 2 口蹄疫病毒 | 第17-19页 |
| ·口蹄疫病毒结构 | 第17-18页 |
| ·病毒受体研究 | 第18-19页 |
| 综述二 整联蛋白分子生物学研究 | 第19-23页 |
| 1 整联蛋白的结构 | 第19页 |
| 2 α亚基和β亚基 | 第19-20页 |
| 3 整联蛋白构象及配位子的识别 | 第20-21页 |
| 4 典型的整联蛋白配位子和识别序列 | 第21页 |
| 5 整联蛋白作为信号传导受体 | 第21页 |
| 6 整联蛋白研究进展 | 第21-23页 |
| 综述三 RNA干扰技术 | 第23-27页 |
| 1 RNAi的作用机制 | 第23-24页 |
| 2 siRNA的构建和设计原则 | 第24页 |
| 3 RNAi的应用 | 第24-25页 |
| ·基因敲除研究 | 第24-25页 |
| ·基因功能研究 | 第25页 |
| ·基因治疗的应用 | 第25页 |
| 4 转基因技术 | 第25-27页 |
| ·显微注射法 | 第25-26页 |
| ·体细胞核移植技术 | 第26页 |
| ·转座子介导的基因转移技术 | 第26页 |
| ·慢病毒载体法 | 第26页 |
| ·TALENs-基因打靶技术 | 第26-27页 |
| 研究目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二章 实验部分 | 第28-70页 |
| 实验一 靶向FMDV受体β6亚基干扰载体的构建 | 第28-38页 |
| 摘要 | 第28页 |
| 1 材料和方法 | 第28-32页 |
| ·菌株和载体、主要试剂 | 第28页 |
| ·主要实验仪器 | 第28-29页 |
| ·方法 | 第29-32页 |
| ·靶序列的设计和筛选 | 第29页 |
| ·载体插入序列的设计及合成 | 第29页 |
| ·目的片段合链 | 第29页 |
| ·连接 | 第29-30页 |
| ·感受态细胞DH5α的制备 | 第30页 |
| ·转化E.coliDH5α感受态细胞 | 第30页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第30-31页 |
| ·重组质粒的大量制备 | 第31页 |
| ·大提质粒后的纯化与浓缩 | 第31-32页 |
| 2 结果 | 第32-34页 |
| ·靶序列的siRNA的合成及筛选 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的克隆与酶切 | 第33-34页 |
| ·序列的测定及大提质粒浓度 | 第34页 |
| 3 讨论 | 第34-38页 |
| ·整联蛋白介导病毒感染 | 第34-35页 |
| ·RNAi技术在转基因中的应用 | 第35-38页 |
| 实验二 细胞水平上重组质粒干扰FMDV整联蛋白受体β6亚基的效果分析 | 第38-56页 |
| 摘要 | 第38-39页 |
| 1 材料与方法 | 第39-45页 |
| ·材料 | 第39页 |
| ·细胞、菌株和载体 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39页 |
| ·主要仪器设备 | 第39页 |
| ·方法 | 第39-45页 |
| ·猪胚胎成纤维细胞的分离培养 | 第39-40页 |
| ·BHK-21细胞和猪胚胎成纤维细胞的培养 | 第40-41页 |
| ·细胞转染 | 第41页 |
| ·BHK-21细胞与PEF细胞总RNA的提取 | 第41-42页 |
| ·cDNA的合成 | 第42页 |
| ·FMDV整联蛋白β6亚基基因及内参基因β-actin实时荧光定量引物设计 | 第42-43页 |
| ·猪源和鼠源β6基因和β-actin内参基因的克隆 | 第43-44页 |
| ·FMDV整联蛋白受体β6亚基基因和β-actin内参基因实时荧光定量PCR检测 | 第44-45页 |
| 2 结果 | 第45-53页 |
| ·猪胚胎成纤维细胞的分离培养 | 第45-46页 |
| ·干扰重组质粒转染BHK细胞和PEF细胞 | 第46-47页 |
| ·BHK-21细胞与PEF细胞总RNA的提取 | 第47页 |
| ·猪源和鼠源β6基因和β-actin内参基因的克隆结果 | 第47-49页 |
| ·FMDV整联蛋白受体β6亚基基因和β-actin内参基因实时荧光定量PCR检测结果 | 第49-52页 |
| ·猪源与鼠源β6亚基基因的序列分析 | 第52-53页 |
| 3 讨论 | 第53-56页 |
| ·GFP的应用及PEF细胞转染技术 | 第53-54页 |
| ·qRT-PCR技术的应用 | 第54-56页 |
| 实验三 整合U6-Z4基因的猪胚胎成纤维细胞的构建 | 第56-70页 |
| 摘要 | 第56页 |
| 1 材料与方法 | 第56-60页 |
| ·材料 | 第56-57页 |
| ·细胞、菌株和载体 | 第56-57页 |
| ·主要试剂 | 第57页 |
| ·主要仪器设备 | 第57页 |
| ·方法 | 第57-60页 |
| ·成纤维细胞的复苏与培养 | 第57页 |
| ·PXL-U6-Z4表达质粒的构建 | 第57-58页 |
| ·转染用目的DNA片段的制备 | 第58-59页 |
| ·线性化PXL-U6-Z4质粒转染PEF细胞 | 第59页 |
| ·抗性细胞的筛选 | 第59页 |
| ·实时荧光定量PCR验证整合载体的干扰效果 | 第59页 |
| ·口蹄疫病毒TCID50测定及转染细胞的攻毒检测 | 第59-60页 |
| ·实时荧光定量PCR检测FMDV的复制 | 第60页 |
| 2 结果 | 第60-68页 |
| ·U6-Z4目的基因的酶切结果 | 第60-61页 |
| ·重组质粒的克隆与酶切 | 第61-62页 |
| ·线性化PXL-U6-Z4的获得及细胞转染 | 第62-63页 |
| ·实时荧光定量PCR验证整合载体的干扰效果 | 第63-65页 |
| ·转染整合载体及攻毒后检测结果 | 第65-67页 |
| ·qRT-PCR检测病毒复制量 | 第67-68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| ·细胞转染及G418筛选 | 第68-69页 |
| ·荧光定量及细胞攻毒 | 第69-70页 |
| 结论 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
| 附录 | 第78-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 作者简介 | 第85-86页 |
| 导师评阅表 | 第86页 |
