| 致谢 | 第1-6页 |
| 前言 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-53页 |
| 引言 | 第17页 |
| ·基因工程药物 | 第17-18页 |
| ·基因工程药物研究开发中的若干关键问题 | 第18-33页 |
| ·蛋白质的重组表达技术 | 第18-21页 |
| ·重组蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达策略 | 第19-20页 |
| ·重组蛋白质的高水平表达-包涵体 | 第20-21页 |
| ·蛋白质复性 | 第21-25页 |
| ·蛋白质的折叠机理 | 第21-22页 |
| ·包涵体蛋白复性方法 | 第22-23页 |
| ·影响复性的因素 | 第23-24页 |
| ·提高复性效率的策略 | 第24-25页 |
| ·复性效果的检测方法 | 第25页 |
| ·蛋白质的分离纯化技术 | 第25-26页 |
| ·蛋白质稳定性研究 | 第26-33页 |
| ·引起蛋白质类药物不稳定的原因 | 第27页 |
| ·蛋白质的化学不稳定性 | 第27-30页 |
| ·蛋白质氧化及作用机制 | 第27-28页 |
| ·蛋白质脱酰胺反应及作用机制 | 第28页 |
| ·还原作用与二硫键的错配 | 第28-29页 |
| ·β-消除和消旋化反应 | 第29页 |
| ·水解作用 | 第29页 |
| ·形成DKP(Diketopiperazine,二酮哌嗪或环缩二氨酸) | 第29页 |
| ·形成焦谷氨酸(PyroGlu Formation) | 第29-30页 |
| ·蛋白质的糖化(Glycation of Proteins) | 第30页 |
| ·蛋白质的物理不稳定性 | 第30-31页 |
| ·提高蛋白质稳定性的策略 | 第31-33页 |
| ·添加蛋白质稳定剂 | 第31页 |
| ·干燥法 | 第31-32页 |
| ·蛋白质工程 | 第32-33页 |
| ·蛋白质的化学修饰 | 第33页 |
| ·促红细胞生成素模拟肽(EMP1) | 第33-37页 |
| ·促红细胞生成素模拟肽的发现 | 第33-34页 |
| ·EMP1研究进展 | 第34-37页 |
| ·EMP1的关键序列 | 第34-35页 |
| ·二聚化或四聚化等提高EMP1的生物活性 | 第35-37页 |
| ·EMP1生产方法 | 第37页 |
| ·骨形态发生蛋白-2 | 第37-44页 |
| ·骨形态发生蛋白-2简介 | 第37-39页 |
| ·BMP-2的研究进展 | 第39-44页 |
| ·重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的产品稳定性 | 第44-51页 |
| ·重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF) | 第44-46页 |
| ·rhG-CSF稳定性研究进展 | 第46-51页 |
| ·rhG-CSF的制剂开发 | 第46-47页 |
| ·rhG-CSF的质量标准研究 | 第47-48页 |
| ·rhG-CSF的稳定性评价 | 第48-49页 |
| ·提高rhG-CSF的稳定性的策略 | 第49-51页 |
| ·本论文的研究目的和主要研究内容 | 第51-53页 |
| 第二章 促红细胞生成素模拟肽(EMP1)在大肠杆菌中的可溶性表达和活性测定 | 第53-71页 |
| ·引言 | 第53页 |
| ·实验材料与方法 | 第53-61页 |
| ·实验材料 | 第53-55页 |
| ·质粒 | 第53页 |
| ·菌种 | 第53-54页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第54页 |
| ·培养基 | 第54页 |
| ·化学试剂及仪器 | 第54-55页 |
| ·实验方法 | 第55-61页 |
| ·EMP-1基因的获得 | 第55页 |
| ·分子克隆相关实验 | 第55页 |
| ·EMP1的可溶性表达 | 第55-57页 |
| ·大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取 | 第57-58页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第58页 |
| ·EMP1二串体的制备和分离 | 第58-59页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第59-60页 |
| ·大肠杆菌菌体浓度测定 | 第60页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第60页 |
| ·EMP-1的细胞活性测定法(MTT法) | 第60-61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-69页 |
| ·EMP1工程菌的构建 | 第61-62页 |
| ·EMP1融合蛋白的表达 | 第62-65页 |
| ·EMP1融合蛋白的纯化和EMP1的制备 | 第65-67页 |
| ·EMP1融合蛋白及EMP1的生物活性比较 | 第67-69页 |
| ·本章小结 | 第69-71页 |
| 第三章 重组人骨形态发生蛋白-2的复性和纯化工艺研究 | 第71-91页 |
| ·引言 | 第71-72页 |
| ·实验材料与方法 | 第72-77页 |
| ·实验材料 | 第72页 |
| ·rhBMP-2包涵体 | 第72页 |
| ·化学试剂及仪器 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-77页 |
| ·rhBMP-2的表达和包涵体制备 | 第72页 |
| ·rhBMP-2包涵体的溶解(裂解) | 第72-74页 |
| ·rhBMP-2的复性 | 第74页 |
| ·rhBMP-2复性液的纯化及条件优化 | 第74-76页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第76页 |
| ·SDS-PAGE法测定rhBMP-2纯度 | 第76页 |
| ·毛细管电泳法测定rhBMP-2纯度 | 第76页 |
| ·碱性磷酸酶生物活性测定(ALP) | 第76-77页 |
| ·成骨活性测定(Ectopic bone formation) | 第77页 |
| ·结果与讨论 | 第77-90页 |
| ·rhBMP-2的表达和包涵体制备 | 第77-78页 |
| ·不同变性剂体系对rhBMP-2包涵体提取效果的比较 | 第78-79页 |
| ·复性液组成对rhBMP-2复性效果的比较 | 第79-80页 |
| ·rhBMP-2复性液的初步纯化 | 第80-83页 |
| ·rhBMP-2的精制工艺优化 | 第83-87页 |
| ·有机溶剂和尿素对纯化的影响 | 第83-84页 |
| ·N,N-二甲基甲酰胺浓度的优化 | 第84-85页 |
| ·尿素浓度的优化 | 第85-87页 |
| ·rhBMP-2复性液提纯的两步法工艺 | 第87-90页 |
| ·本章小结 | 第90-91页 |
| 第四章 重组人骨形态发生蛋白-2的复性和纯化工艺的放大 | 第91-105页 |
| ·引言 | 第91页 |
| ·实验材料与方法 | 第91-94页 |
| ·实验材料 | 第91页 |
| ·rhBMP-2包涵体 | 第91页 |
| ·化学试剂及仪器 | 第91页 |
| ·实验方法 | 第91-94页 |
| ·rhBMP-2包涵体的溶解(裂解) | 第91-92页 |
| ·rhBMP-2的复性 | 第92页 |
| ·rhBMP-2的两步法纯化 | 第92页 |
| ·rhBMP-2的后续处理 | 第92-93页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第93页 |
| ·rhBMP-2终产品的DMF残留检测 | 第93页 |
| ·rhBMP-2的电泳法纯度测定(SDS-PAGE) | 第93页 |
| ·rhBMP-2的毛细管电泳法纯度测定 | 第93页 |
| ·反相HPLC法测定rhBMP-2的纯度 | 第93-94页 |
| ·SEC HPLC法测定rhBMP-2的纯度 | 第94页 |
| ·碱性磷酸酶生物活性测定(ALP) | 第94页 |
| ·成骨活性测定(Ectopic bone formation) | 第94页 |
| ·结果与讨论 | 第94-103页 |
| ·rhBMP-2的复性 | 第94-95页 |
| ·rhBMP-2的纯化及纯度分析 | 第95-101页 |
| ·rhBMP-2中的DMF残留验证 | 第101-102页 |
| ·rhBMP-2的生物活性 | 第102-103页 |
| ·本章小结 | 第103-105页 |
| 第五章 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的稳定性研究 | 第105-135页 |
| ·引言 | 第105页 |
| ·实验材料与方法 | 第105-121页 |
| ·实验材料 | 第105-107页 |
| ·rhG-CSF包涵体 | 第105页 |
| ·化学试剂及仪器 | 第105-107页 |
| ·实验方法 | 第107-121页 |
| ·复性方法 | 第107页 |
| ·纯化方法 | 第107-109页 |
| ·制剂灌封试验 | 第109页 |
| ·反相HPLC法 | 第109-111页 |
| ·反相HPLC法测定rhG-CSF及其氧化产物条件的优化 | 第111-113页 |
| ·柱温的优化 | 第111页 |
| ·上样量的影响 | 第111-112页 |
| ·柱长对检测结果的影响 | 第112-113页 |
| ·反相HPLC法测定rhG-CSF及其氧化产物的方法学研究 | 第113-114页 |
| ·检测限的确定 | 第113页 |
| ·专属性 | 第113页 |
| ·耐用性 | 第113-114页 |
| ·SDS-PAGE法纯度分析 | 第114页 |
| ·毛细管电泳法纯度分析 | 第114-115页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第115-116页 |
| ·细菌内毒素检验法 | 第116-119页 |
| ·生物活性测定法 | 第119-120页 |
| ·pH值测定法 | 第120-121页 |
| ·37℃加速和4℃长期稳定性试验 | 第121页 |
| ·结果与讨论 | 第121-134页 |
| ·复性工艺对rhG-CSF稳定性的影响 | 第121页 |
| ·纯化工艺对rhG-CSF产品稳定性的影响 | 第121-122页 |
| ·制剂工艺对稳定性的影响 | 第122-131页 |
| ·包装材料的影响 | 第122-123页 |
| ·不同过渡态金属离子对安瓿瓶制剂的影响 | 第123-124页 |
| ·不同厂家来源的安瓿瓶对制剂稳定性的影响 | 第124-126页 |
| ·不同厂家来源的胶塞对西林瓶制剂稳定性的影响 | 第126-127页 |
| ·预装针制剂的稳定性试验 | 第127-128页 |
| ·制剂原辅料及环境对rhG-CSF稳定性的影响 | 第128-131页 |
| ·工艺改进对稳定性的影响 | 第131-133页 |
| ·工艺改进后产品稳定性的评价 | 第133-134页 |
| ·本章小结 | 第134-135页 |
| 第六章 结论和建议 | 第135-138页 |
| ·结论 | 第135-136页 |
| ·建议 | 第136-138页 |
| 参考文献 | 第138-151页 |
| 作者简历 | 第151页 |
| 作者简介 | 第151页 |
| 博士期间己发表/录用的文章 | 第151页 |
