| 摘要 | 第1-7页 |
| Summary | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1 导言 | 第9页 |
| 2 植物抗寒机理研究进展 | 第9-12页 |
| ·植物抗寒生理生化研究 | 第9-11页 |
| ·膜系统与植物的抗寒性 | 第9-10页 |
| ·细胞抗氧化系统与植物的抗寒性 | 第10页 |
| ·细胞渗透调节物质与植物的抗寒性 | 第10页 |
| ·植物生长物质与植物的抗寒性 | 第10-11页 |
| ·植物抗寒的分子机理研究 | 第11-12页 |
| ·膜稳定性相关基因 | 第11页 |
| ·抗氧化酶活性基因 | 第11页 |
| ·抗氧化酶基因 | 第11页 |
| ·抗冻蛋白基因 | 第11页 |
| ·低温信号转录因子 | 第11-12页 |
| 3 低温诱导型转录因子CBF的研究进展 | 第12-15页 |
| ·CBF转录因子的发现与鉴定 | 第12-13页 |
| ·CBF转录因子的结构与特性 | 第13页 |
| ·CBF转录因子调控的生理生化功能 | 第13-14页 |
| ·CBF转录因子在抗逆条件下的交叉适应现象 | 第14页 |
| ·CBF转录因子的应用前景 | 第14-15页 |
| 4 基因工程中常用启动子 | 第15-17页 |
| ·概念 | 第15页 |
| ·启动子的特征与结构 | 第15-16页 |
| ·启动子的分类 | 第16-17页 |
| ·组成型启动子 | 第16页 |
| ·诱导型启动子 | 第16页 |
| ·组织或器官特异型启动子 | 第16-17页 |
| 5 本实验目的及意义 | 第17-18页 |
| 第二章 三种不同抗冻性葡萄CBF_2转录因子的克隆及生物信息学分析 | 第18-32页 |
| 1 材料与试剂 | 第18-20页 |
| ·植物材料 | 第18页 |
| ·菌株及载体 | 第18页 |
| ·酶及试剂盒 | 第18页 |
| ·实验仪器与设备 | 第18页 |
| ·试剂及培养基的配方 | 第18-20页 |
| 2 实验方法 | 第20-25页 |
| ·三种不同抗冻性葡萄总DNA的提取及浓度检测 | 第20-21页 |
| ·三种葡萄总DNA的提取 | 第20-21页 |
| ·检测DNA的质量与纯度 | 第21页 |
| ·CBF_2转录因子的PCR扩增 | 第21-22页 |
| ·引物设计 | 第21页 |
| ·目的片段的PCR扩增 | 第21-22页 |
| ·CBF_2扩增产物的回收 | 第22页 |
| ·目的片段与pMD18-T载体连接 | 第22-23页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α | 第23-24页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第23页 |
| ·连接产物的转化 | 第23-24页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第24-25页 |
| ·Amp抗性筛选和碱裂解法提取质粒DNA | 第24页 |
| ·重组质粒PCR及双酶切鉴定 | 第24-25页 |
| ·三种葡萄CBF_2序列测定及生物信息学分析 | 第25页 |
| 3 结果与分析 | 第25-30页 |
| ·三种葡萄总DNA质量分析 | 第25页 |
| ·CBF_2转录因子的PCR扩增及阳性克隆鉴定 | 第25-27页 |
| ·三种不同抗冻性葡萄CBF_2基因序列的生物信息学分析 | 第27-30页 |
| ·三种葡萄CBF_2转录因子的核苷酸序列分析 | 第27-28页 |
| ·三种葡萄CBF_2转录因子的氨基酸序列比对及进化树分析 | 第28-29页 |
| ·基于三种葡萄CBF_2转录因子蛋白质一级结构的分析 | 第29-30页 |
| ·氨基酸组成及其理化性质 | 第29页 |
| ·氨基酸序列疏水性/亲水性预测及分析 | 第29-30页 |
| 4 讨论 | 第30-32页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·PCR反应的优化 | 第30-31页 |
| ·反映体系的优化 | 第30-31页 |
| ·反应条件的优化 | 第31页 |
| ·三种葡萄CBF_2转录因子的生物信息学差异 | 第31-32页 |
| 第三章 表达载体pBI121-CaMV35S-CBF_2的构建及转化 | 第32-43页 |
| 1 材料与试剂 | 第32-34页 |
| ·植物材料 | 第32页 |
| ·菌株及载体 | 第32页 |
| ·酶及试剂盒 | 第32页 |
| ·实验仪器与设备 | 第32页 |
| ·试剂及培养基的配方 | 第32-34页 |
| ·主要试剂的配方 | 第32页 |
| ·培养基的配方 | 第32-34页 |
| 2 试验方法 | 第34-37页 |
| ·CBF_2基因的制备 | 第34-35页 |
| ·质粒pMD18-CBF_2的提取 | 第34页 |
| ·目的基因CBF_2的PCR扩增 | 第34页 |
| ·CBF_2基因的双酶切及回收 | 第34-35页 |
| ·CBF_2基因PCR扩增后回收 | 第34页 |
| ·回收后CBF_2基因的双酶切 | 第34-35页 |
| ·CBF_2基因双酶切后回收 | 第35页 |
| ·载体的制备 | 第35页 |
| ·质粒pBI121 的提取 | 第35页 |
| ·质粒pBI121 双酶切 | 第35页 |
| ·酶切后载体的回收 | 第35页 |
| ·目的基因与载体的连接及转化大肠杆菌 | 第35-36页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的制备及CBF_2的冻融法转化 | 第36页 |
| ·Kan抗性筛选和碱裂解法提取质粒DNA | 第36-37页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第37页 |
| ·烟草再生体系的建立 | 第37页 |
| ·烟草无菌苗的培养 | 第37页 |
| ·烟草愈伤组织的诱导 | 第37页 |
| ·愈伤组织分化及植株再生 | 第37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-41页 |
| ·目的基因和载体 | 第37-39页 |
| ·重组质粒pBI121-CaMV35S-CBF_2的鉴定 | 第39-40页 |
| ·pBI121-CaMV35S-CBF_2转化农杆菌LBA440432 | 第40页 |
| ·烟草再生体系 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41-43页 |
| ·植物表达载体的选择 | 第41-42页 |
| ·目的基因和载体对连接反应的影响 | 第42页 |
| ·烟草再生体系在后续转基因中的作用 | 第42-43页 |
| 第四章 结论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-49页 |
| 致谢 | 第49-50页 |
| 导师简介 | 第50-51页 |
| 作者简介 | 第51-52页 |
