| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-45页 |
| ·有机磷化合物及其神经毒性 | 第13-15页 |
| ·细菌磷酸三酯酶 | 第15-20页 |
| ·底物特异性和立体选择性 | 第16页 |
| ·X-ray 结构 | 第16-17页 |
| ·催化机理 | 第17-18页 |
| ·磷酸三酯酶的潜在应用 | 第18-20页 |
| ·磷酸三酯酶的趋异进化 | 第20-22页 |
| ·蛋白质工程简介 | 第22-30页 |
| ·蛋白质的理性设计 | 第23-26页 |
| ·底物特异性与立体选择性的改造 | 第24页 |
| ·活力改造 | 第24-25页 |
| ·稳定性改造 | 第25页 |
| ·酶分子结构元件嫁接 | 第25-26页 |
| ·蛋白质的非理性设计 | 第26-28页 |
| ·易错 PCR (error-prone PCR) | 第27页 |
| ·同源基因重组 (homology-dependent gene recombination) | 第27-28页 |
| ·蛋白质的半理性设计 | 第28-30页 |
| ·特定区域的随机突变 | 第28-29页 |
| ·随机突变后的定点饱和突变 | 第29页 |
| ·计算机辅助的半理性设计 | 第29-30页 |
| ·分子进化类磷酸三酯的酶内酯酶 | 第30页 |
| ·其它有机磷水解酶类 | 第30-34页 |
| ·二异丙基氟磷酸酯酶 (diisopropylfluorophosphatase, DFPases) | 第30-31页 |
| ·血清对氧磷酶 (Serum paraoxonase, PON) | 第31-32页 |
| ·有机磷酸酸酐水解酶 (Organophosphorus acid anhydrolase, OPAA) | 第32-33页 |
| ·甲基对硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase, MPH) | 第33-34页 |
| ·立题依据和实验设计 | 第34-35页 |
| ·参考文献 | 第35-45页 |
| 第二章 嗜热磷酸三酯酶基因的克隆、表达及工程菌构建 | 第45-59页 |
| ·引言 | 第45页 |
| ·实验材料 | 第45-47页 |
| ·菌株和质粒 | 第45页 |
| ·主要试剂 | 第45-46页 |
| ·主要仪器 | 第46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| ·使用的数据库及软件 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-53页 |
| ·Geobacillus kaustophilus HTA426 的复苏及培养 | 第47-48页 |
| ·G. kaustophilus HTA426 基因组 DNA 的提取 | 第48页 |
| ·来源于嗜热细菌 G. kaustophilus HTA426 的磷酸三酯酶基因的克隆 | 第48-51页 |
| ·引物设计 | 第48-49页 |
| ·GK1506 基因的 PCR 扩增 | 第49页 |
| ·GK1506 的酶切和纯化 | 第49-50页 |
| ·pET-28a 载体制备 | 第50页 |
| ·连接产物的转化 | 第50页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第50-51页 |
| ·连接产物的转化 | 第51页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第51页 |
| ·GK1506 基因的预表达 | 第51-52页 |
| ·GkaP 的分离纯化 | 第52页 |
| ·蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第52-53页 |
| ·结果与讨论 | 第53-57页 |
| ·同源序列比对及进化关系分析 | 第53-54页 |
| ·磷酸三酯酶 GK1506 基因的 PCR 扩增 | 第54-55页 |
| ·重组质粒的构建、转化及阳性克隆的鉴定 | 第55-56页 |
| ·目的蛋白的表达和纯化 | 第56-57页 |
| ·小结 | 第57页 |
| ·参考文献 | 第57-59页 |
| 第三章 GkaP 的酶学性质 | 第59-73页 |
| ·引言 | 第59页 |
| ·材料与方法 | 第59-63页 |
| ·实验材料 | 第59页 |
| ·酶活力测定方法 | 第59-60页 |
| ·磷酸三酯酶活力测定方法 | 第59-60页 |
| ·内酯酶活力测定方法 | 第60页 |
| ·羧酸酯酶活力测定方法 | 第60页 |
| ·最适温度和热稳定性测定 | 第60-61页 |
| ·最适 pH 和 pH 稳定性测定 | 第61页 |
| ·动力学常数的测定 | 第61页 |
| ·不同的二价金属离子取代对酶活性的影响 | 第61-62页 |
| ·金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响 | 第62页 |
| ·蛋白的金属含量测定 | 第62-63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-69页 |
| ·GkaP 的最适温度和热稳定性 | 第63-64页 |
| ·GkaP 的最适 pH 和 pH 稳定性 | 第64页 |
| ·GkaP 的催化“非专一性” | 第64-67页 |
| ·不同的二价离子构建的 GkaP 对酶活力的影响 | 第67页 |
| ·GkaP 的金属含量分析 | 第67-68页 |
| ·金属螯合剂、有机溶剂及去污剂对 GkaP 活力的影响 | 第68-69页 |
| ·小结 | 第69-70页 |
| ·参考文献 | 第70-73页 |
| 第四章 GkaP 活性中心附近热点氨基酸的突变体设计与功能研究 | 第73-91页 |
| ·引言 | 第73-76页 |
| ·实验方法 | 第76-79页 |
| ·同源序列比对 | 第76页 |
| ·定点突变和定点饱和突变 | 第76-77页 |
| ·饱和突变库的筛选 | 第77-78页 |
| ·野生型 GkaP 及其突变体的表达、纯化 | 第78页 |
| ·动力学常数测定 | 第78页 |
| ·野生型 GkaP 及其突变体对各种杀虫剂的比活力测定 | 第78-79页 |
| ·底物的分子对接 | 第79页 |
| ·结果与讨论 | 第79-87页 |
| ·GkaP 的 Tyr~(99)和 Arg~(230)位点饱和突变库的构建和筛选 | 第79-80页 |
| ·突变体的动力学常数分析 | 第80-82页 |
| ·突变体对于几种有机磷杀虫剂的比活力 | 第82-84页 |
| ·GkaP 突变体活力变化的结构基础 | 第84-87页 |
| ·小结 | 第87-88页 |
| ·参考文献 | 第88-91页 |
| 第五章 GkaP 的分子进化—提高对有机磷杀虫剂的降解活力 | 第91-107页 |
| ·引言 | 第91页 |
| ·实验方法 | 第91-95页 |
| ·定点突变和定点饱和突变 | 第91-92页 |
| ·全基因易错 PCR 突变库的构建 | 第92-93页 |
| ·突变库筛选 | 第93页 |
| ·突变体的表达和纯化 | 第93-94页 |
| ·动力学常数和各种杀虫剂比活力测定方法 | 第94页 |
| ·突变体的热稳定性、最适温度和 pH 测定 | 第94页 |
| ·突变体的同源建模 | 第94-95页 |
| ·结果与讨论 | 第95-105页 |
| ·GkaP 的进化策略 | 第95-96页 |
| ·突变体的动力学常数分析 | 第96-100页 |
| ·突变体的热稳定性分析 | 第100-101页 |
| ·突变体的生化性质表征 (最适温度和最适 pH) | 第101页 |
| ·突变体对不同有机磷杀虫剂的比活力 | 第101-104页 |
| ·突变位点的结构分析 | 第104-105页 |
| ·小结 | 第105-106页 |
| ·参考文献 | 第106-107页 |
| 创新点 | 第107-109页 |
| 展望 | 第109-111页 |
| 作者简历 | 第111页 |
| 攻读博士期间发表成果 | 第111-113页 |
| 参与的科研课题 | 第113-115页 |
| 致谢 | 第115页 |
