| 致 谢 | 第1-12页 |
| 中文摘要 | 第12-14页 |
| 英文摘要 | 第14-17页 |
| 第一篇 黄瓜花叶病毒复制酶基因表达载体构建和遗传转化 | 第17-84页 |
| 引 言 | 第18-20页 |
| 第一章 植物抗病毒基因工程研究进展 | 第20-31页 |
| 1 利用病毒基因的植物抗病毒基因工程策略 | 第21-28页 |
| 1．1 外壳蛋白介导的保护作用 | 第21-23页 |
| 1．2 复制酶介导的保护作用 | 第23-25页 |
| 1．3 移动蛋白介导的保护作用 | 第25-26页 |
| 1．4 弱毒株全长cDNA介导的抗性 | 第26页 |
| 1．5 病毒卫星RNA介导的抗性 | 第26-27页 |
| 1．6 反义RNA介导的抗性 | 第27页 |
| 1．7 核酶（ribozyme）介导抗性 | 第27-28页 |
| 2 非病毒来源基因介导的抗性 | 第28-31页 |
| 2．1 来源于植物本身的抗性基因 | 第28-29页 |
| 2．2 病毒复制干扰型分子 | 第29-30页 |
| 2．3 植物抗体（plantibody）基因 | 第30-31页 |
| 第二章 植物基因转化 | 第31-42页 |
| 1 植物基因转化受体系统应具备的条件 | 第31-33页 |
| 1．1 高效稳定的再生能力 | 第31页 |
| 1．2 较高的遗传稳定性 | 第31-32页 |
| 1．3 具有稳定的外植体来源 | 第32页 |
| 1．4 对选择性抗生素敏感 | 第32页 |
| 1．5 对农杆菌侵染有敏感性 | 第32-33页 |
| 2 植物基因转化受体系统的类型及其特性 | 第33-34页 |
| 2．1 愈伤组织再生系统 | 第33页 |
| 2．2 直接分化再生系统 | 第33页 |
| 2．3 原生质体再生系统 | 第33-34页 |
| 3 植物转化载体系统 | 第34页 |
| 3．1 病毒载体系统 | 第34页 |
| 3．2 质粒载体系统 | 第34页 |
| 4 植物基因转化方法 | 第34-35页 |
| 5 转基因植物的筛选和鉴定 | 第35-36页 |
| 6 根癌农杆菌介导的植物基因转化研究进展 | 第36-42页 |
| 6．1 农杆菌Ti质粒 | 第36-37页 |
| 6．2 Ti质粒衍生的载体系统 | 第37页 |
| 6．3 植物基因转化载体系统 | 第37-38页 |
| 6．3．1 中间载体和卸甲载体 | 第37页 |
| 6．3．2 中间载体的构建 | 第37-38页 |
| 6．4 中间表达载体导入农杆菌 | 第38-39页 |
| 6．5 转基因植物中外源基因的表达状况与转基因植物的遗传行为 | 第39-42页 |
| 6．5．1 外源基因的整合、表达 | 第39页 |
| 6．5．2 基因沉默 | 第39-42页 |
| 第三章 不同长度黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体的构建 | 第42-57页 |
| 1 材料与方法 | 第42-52页 |
| 1．1 材料 | 第42页 |
| 1．1．1 菌种、质粒 | 第42页 |
| 1．1．2 酶、化学试剂 | 第42页 |
| 1．1．3 抗生素 | 第42页 |
| 1．1．4 常用缓冲液的配制 | 第42页 |
| 1．2 方法 | 第42-52页 |
| 1．2．1 目的基因的获得 | 第42-46页 |
| 1．2．1．1 全长2a Replicase基因的扩增： | 第42-43页 |
| 1．2．1．2 5'端和3'端缺失的Replicase基因的扩增： | 第43-44页 |
| 1．2．1．3 缺失GDD保守区的CMV复制酶基因的扩增 | 第44-46页 |
| 1．2．1．3．1 全长的2a复制酶基因PCR产物的纯化 | 第44-45页 |
| 1．2．1．3．2 PCR纯化产物的双酶切及割胶回收 | 第45-46页 |
| 1．2．1．3．3 酶切产物连接及PCR扩增 | 第46页 |
| 1．2．2 DNA克隆技术 | 第46-50页 |
| 1．2．2．1 连接方法 | 第46页 |
| 1．2．2．2 感受态细胞制备方法 | 第46-47页 |
| 1．2．2．3 转化 | 第47页 |
| 1．2．2．4 重组克隆的筛选与鉴定 | 第47-48页 |
| 1．2．2．4．1 煮沸法少量提取质粒 | 第47页 |
| 1．2．2．4．2 碱裂解法提取质粒 | 第47-48页 |
| 1．2．2．5 重组质粒PCR鉴定 | 第48页 |
| 1．2．2．6 重组质粒的提取纯化 | 第48-49页 |
| 1．2．2．7 DNA序列测定及分析 | 第49-50页 |
| 1．2．2．7．1 测序反应 | 第49-50页 |
| 1．2．2．7．2 在Pharmacia ALFexprecs全自动测序仪上进行序列测定 | 第50页 |
| 1．2．3 不同缺失型CMV复制酶基因植物重组表达载体的构建 | 第50-51页 |
| 1．2．3．1 不同缺失型CMV复制酶基因的获得 | 第50页 |
| 1．2．3．1．1 RP基因及RP-△GDD复制酶基因的获得 | 第50页 |
| 1．2．3．1．2 P1-RP复制酶基因的酶切 | 第50页 |
| 1．2．3．2 植物表达载体PBI121酶切 | 第50页 |
| 1．2．3．3 连接转化及重组克隆的筛选 | 第50-51页 |
| 1．2．3．3．1 连接及转化 | 第50-51页 |
| 1．2．3．3．2 重组克隆的筛选与鉴定 | 第51页 |
| 1．2．4 植物表达载体导入受体农杆菌 | 第51-52页 |
| 1．2．4．1 三亲交配 | 第51页 |
| 1．2．4．2 a-乳糖酮基反应 | 第51-52页 |
| 2 结果与分析 | 第52-54页 |
| 2．1 目的基因的克隆及序列测定 | 第52-53页 |
| 2．2 植物中间表达载体的构建和鉴定 | 第53-54页 |
| 2．3 根瘤农杆菌的转化与鉴定 | 第54页 |
| 2．3．1 PCR鉴定 | 第54页 |
| 2．3．2 a-乳糖酮基反应 | 第54页 |
| 3 讨论 | 第54-57页 |
| 第四章 CMV P1-RP基因转化烟草及转基因植物的获得 | 第57-71页 |
| 1 材料 | 第57页 |
| 1．1 受体植物 | 第57页 |
| 1．2 菌株 | 第57页 |
| 1．3 毒源 | 第57页 |
| 1．4 缓冲液、培养基配方及抗生素使用浓度 | 第57页 |
| 2 方法 | 第57-64页 |
| 2．1 叶片感染与植株再生 | 第57-58页 |
| 2．2 转基因烟草的分子生物学鉴定 | 第58-64页 |
| 2．2．1 PCR检测 | 第58-59页 |
| 2．2．2 植物总DNA的提取及Southern blot分析 | 第59-61页 |
| 2．2．2．1 植物总DNA的提取 | 第59页 |
| 2．2．2．2 植物基因组DNA的酶切 | 第59-60页 |
| 2．2．2．3 电泳及转膜 | 第60页 |
| 2．2．2．4 探针标记 | 第60-61页 |
| 2．2．2．5 Southern blot分析 | 第61页 |
| 2．2．3 植物总RNA的提取及Northern blot分析 | 第61-64页 |
| 2．2．3．1 器皿和容器的处理 | 第61-62页 |
| 2．2．3．2 植物RNA的提取 | 第62页 |
| 2．2．3．3 甲醛变性电泳 | 第62页 |
| 2．2．3．4 RNA转膜 | 第62-63页 |
| 2．2．3．5 探针标记： | 第63页 |
| 2．2．3．6 Northern blot分析 | 第63-64页 |
| 2．3 转基因植物的抗性分析 | 第64页 |
| 2．3．1 接种方法 | 第64页 |
| 2．3．2 症状观察 | 第64页 |
| 2．3．3 间接ELISA | 第64页 |
| 3 结果与分析 | 第64-69页 |
| 3．1 烟草叶盘的基因转化和植株的形成 | 第64-66页 |
| 3．2 转基因烟草的分子检测 | 第66-68页 |
| 3．2．1 PCR检测 | 第66页 |
| 3．2．2 转基因烟草的Southern blot分析 | 第66-67页 |
| 3．2．3 转基因烟草Northern blot分析 | 第67-68页 |
| 3．3 抗性分析 | 第68-69页 |
| 3．3．1 症状观察 | 第68-69页 |
| 3．3．2 间接ELISA | 第69页 |
| 4 讨论 | 第69-71页 |
| 第五章 番茄亲本B-1的遗传转化体系建立及转基因番茄的获得 | 第71-84页 |
| 1 材料和方法 | 第71-72页 |
| 1．1 植物材料 | 第71页 |
| 1．2 根癌农杆菌菌株及载体 | 第71页 |
| 1．3 培养基及其添加成分 | 第71页 |
| 1．4 无菌苗的获得 | 第71页 |
| 1．5 外植体转化 | 第71-72页 |
| 1．5．1 预培养 | 第71-72页 |
| 1．5．2 农杆菌的活化 | 第72页 |
| 1．5．3 共培养 | 第72页 |
| 1．5．4 洗涤 | 第72页 |
| 1．5．5 选择培养 | 第72页 |
| 1．6 培养条件 | 第72页 |
| 1．7 转基因番茄的分子生物学鉴定 | 第72页 |
| 1．8 转基因植物的抗性分析 | 第72页 |
| 2 结果和分析 | 第72-78页 |
| 2．1 培养基中不同激素配比对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响 | 第72-73页 |
| 2．2 农杆菌菌株对遗传转化的影响 | 第73页 |
| 2．3 农杆菌浓度及共培养时间对遗传转化的影响 | 第73-74页 |
| 2．4 番茄叶盘的基因转化和植株的形成 | 第74-75页 |
| 2．5 转基因番茄的分子检测 | 第75-78页 |
| 2．5．1 PCR扩增基因 | 第75-76页 |
| 2．5．2 转基因番茄Southern blot分析 | 第76-77页 |
| 2．5．3 转基因番茄Northern blot分析 | 第77-78页 |
| 2．6 抗性测定 | 第78页 |
| 2．6．1 症状观察 | 第78页 |
| 2．6．2 间接ELISA | 第78页 |
| 3 讨论 | 第78-84页 |
| 3．1 培养基中不同激素配比对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响 | 第78-79页 |
| 3．2 激素、农杆菌及农杆菌浓度对遗传转化的影响 | 第79页 |
| 3．3 不同植物对遗传转化的影响 | 第79-80页 |
| 3．4 基因整合和基因表达 | 第80-81页 |
| 3．5 抗病性及抗病机制 | 第81-84页 |
| 第二篇 导入病毒基因的转基因植物释放的风险评估 | 第84-108页 |
| 引言 | 第85-87页 |
| 第六章 转基因作物的安全性及其评价 | 第87-96页 |
| 1 转基因作物的潜在风险 | 第88-92页 |
| 1．1 环境安全性 | 第89-90页 |
| 1．1．1 杂草化问题 | 第89页 |
| 1．1．2 基因扩散 | 第89-90页 |
| 1．1．3 抗病毒转基因作物产生新病毒的风险 | 第90页 |
| 1．1．4 转基因作物释放对土壤生态系统及生物地球化学循环的影响 | 第90页 |
| 1．1．5 转基因植物产生的杀虫剂对非目标生物的影响 | 第90页 |
| 1．1．6 对生物多样性的影响 | 第90页 |
| 1．2 食品安全性 | 第90-92页 |
| 1．2．1 植物基因工程食品对人类健康的可能危害 | 第90-91页 |
| 1．2．2 转基因食品危害产生的机制 | 第91-92页 |
| 2 转基因作物的安全性评价 | 第92-94页 |
| 2．1 环境安全性评价的方法 | 第92-93页 |
| 2．2 植物基因工程食品的评价方法 | 第93-94页 |
| 2．2．1 基于“实质等同性” 的检测和评价措施 | 第93-94页 |
| 2．2．2 美国Fagan博士的检测和评价措施 | 第94页 |
| 3 对策建议 | 第94-96页 |
| 第七章 抗病毒转基因植物释放的风险性评估 | 第96-99页 |
| 第八章 导入病毒基因的转基因植物与接种病毒之间协生重组研究 | 第99-108页 |
| 1 材料 | 第99页 |
| 1．1 毒 源 | 第99页 |
| 1．2 供试寄主 | 第99页 |
| 1．3 抗血清 | 第99页 |
| 1．4 试剂、培养基配方、实验器材 | 第99页 |
| 2 方 法 | 第99-101页 |
| 2．1 转基因烟草的扩繁 | 第99页 |
| 2．2 病毒接种 | 第99-100页 |
| 2．3 症状观察及ELISA检测 | 第100-101页 |
| 2．3．1 症状观察 | 第100页 |
| 2．3．2 ELISA检测 | 第100-101页 |
| 2．3．2．1 TAS-ELISA测定PVX、PVY、TMV | 第100-101页 |
| 2．3．2．2 间接ELISA测定CMV RB | 第101页 |
| 3 结果与分析 | 第101-106页 |
| 3．1 转基因植物与接种病毒之间的协生作用 | 第101-106页 |
| 3．1．1 症状观察 | 第101-102页 |
| 3．1．2 各种病毒在转基因及和转基因植物中浓度的变化 | 第102-106页 |
| 3．1．2．1 PVX在转化ToMV、TMV MP基因及CMV P1-RP基因烟草上病毒含量的变化 | 第102-103页 |
| 3．1．2．2 PVY在转化ToMV、TMV MP基因及CMV P1-RP基因烟草上病毒含量的变化 | 第103-104页 |
| 3．1．2．3 TMV在转化ToMV、TMV MP基因及CMV P1-RP基因烟草上病毒含量的变化 | 第104-105页 |
| 3．1．2．4 CMV RB在转化ToMV、TMV MP基因及CMV P1-RP基因烟草上病毒含量的变化 | 第105-106页 |
| 3．2 转基因植物与接种病毒之间的重组 | 第106页 |
| 4 讨论 | 第106-108页 |
| 全文小结 | 第108-109页 |
| 参考文献 | 第109-116页 |
| 附录A： 本论文所用缩写词及中文对照 | 第116-118页 |
| 附录B： 常用缓冲液及培养基配方 | 第118-126页 |
| 附录C： 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第126-127页 |
