| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-22页 |
| 1 绪论 | 第22-33页 |
| ·研究背景 | 第22-30页 |
| ·EMCV病原学特点 | 第22-25页 |
| ·EMCV基因组结构 | 第22-23页 |
| ·EMCV衣壳蛋白及其功能 | 第23-24页 |
| ·EMCV非结构蛋白P2和P3 | 第24页 |
| ·5'-UTR结构与功能 | 第24-25页 |
| ·3'-UTR结构与功能 | 第25页 |
| ·EMCV致病特点 | 第25-28页 |
| ·易感动物及传播途径 | 第25-26页 |
| ·临床症状及病理变化 | 第26页 |
| ·流行情况 | 第26-27页 |
| ·致病性差异 | 第27-28页 |
| ·EMCV诊断技术 | 第28-29页 |
| ·病毒分离 | 第28页 |
| ·抗体检测方法 | 第28-29页 |
| ·抗原检测方法 | 第29页 |
| ·EMCV的公共卫生学意义 | 第29-30页 |
| ·研究目的及意义 | 第30页 |
| ·研究内容 | 第30-32页 |
| ·猪脑心肌炎病毒快速诊断方法的建立及应用 | 第30-31页 |
| ·猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA方法的建立及应用 | 第31页 |
| ·猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及其基因组分子特征分析 | 第31页 |
| ·小鼠及猪细胞因子TaqMan real-time RT-PCR检测方法的建立 | 第31页 |
| ·猪脑心肌炎病毒分离株的致病性研究 | 第31-32页 |
| ·主要技术路线 | 第32-33页 |
| 2 猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第33-41页 |
| ·前言 | 第33-34页 |
| ·材料与方法 | 第34-36页 |
| ·材料 | 第34-35页 |
| ·引物设计与合成 | 第35页 |
| ·病毒的增殖及毒价测定 | 第35页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第35页 |
| ·一步法RT-PCR条件的优化 | 第35页 |
| ·一步法RT-PCR扩增 | 第35-36页 |
| ·RT-PCR产物的克隆及鉴定 | 第36页 |
| ·一步法RT-PCR的特异性、敏感性和重复性试验 | 第36页 |
| ·一步法RT-PCR的应用 | 第36页 |
| ·结果与分析 | 第36-39页 |
| ·一步法RT-PCR的扩增及鉴定 | 第36-37页 |
| ·一步法RT-PCR的特异性 | 第37-38页 |
| ·一步法RT-PCR的敏感性 | 第38页 |
| ·一步法RT-PCR的重复性 | 第38-39页 |
| ·一步法RT-PCR的应用 | 第39页 |
| ·讨论 | 第39-41页 |
| 3 猪脑心肌炎病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立及应用 | 第41-50页 |
| ·前言 | 第41-42页 |
| ·材料与方法 | 第42-44页 |
| ·病毒 | 第42页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第42页 |
| ·质粒标准品的制备 | 第42-43页 |
| ·Real-time PCR反应条件的优化 | 第43页 |
| ·Real-time PCR标准曲线的制作 | 第43页 |
| ·Real-time PCR的敏感性试验 | 第43页 |
| ·Real-time PCR的特异性试验 | 第43页 |
| ·Real-time PCR的重复性试验 | 第43页 |
| ·Real-time PCR的初步应用 | 第43-44页 |
| ·结果 | 第44-48页 |
| ·质粒标准品的制备 | 第44页 |
| ·Real-time PCR反应条件的优化 | 第44-45页 |
| ·Real-time PCR标准曲线的制作 | 第45-46页 |
| ·Real-time PCR的敏感性分析 | 第46页 |
| ·Real-time PCR的特异性分析 | 第46-47页 |
| ·Real-time PCR的重复性分析 | 第47-48页 |
| ·Real-time RT-PCR的初步应用 | 第48页 |
| ·讨论 | 第48-50页 |
| 4 猪脑心肌炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第50-60页 |
| ·前言 | 第50-51页 |
| ·材料与方法 | 第51-53页 |
| ·病毒及实验动物 | 第51页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第51-52页 |
| ·引物及探针的设计与合成 | 第52页 |
| ·重组质粒标准品的制备 | 第52页 |
| ·标准曲线的制作 | 第52-53页 |
| ·敏感性试验 | 第53页 |
| ·特异性试验 | 第53页 |
| ·重复性试验 | 第53页 |
| ·Real-time PCR的应用 | 第53页 |
| ·结果 | 第53-57页 |
| ·质粒标准品的制备 | 第53-54页 |
| ·Real-time PCR反应条件的优化 | 第54页 |
| ·Real-time PCR标准曲线的制作 | 第54-55页 |
| ·敏感性分析 | 第55页 |
| ·特异性分析 | 第55-56页 |
| ·重复性分析 | 第56页 |
| ·Real-time PCR的应用 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-60页 |
| 5 猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表达及鉴定 | 第60-67页 |
| ·前言 | 第60页 |
| ·材料与方法 | 第60-62页 |
| ·病毒、表达质粒和宿主菌 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| ·表达引物设计 | 第61页 |
| ·病毒RNA的提取及VP1基因RT-PCR扩增 | 第61-62页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第62页 |
| ·重组质粒的诱导表达 | 第62页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第62页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第62页 |
| ·重组蛋白的Western blot检测 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-65页 |
| ·重组表达质粒的构建与鉴定 | 第63页 |
| ·表达产物的鉴定 | 第63-64页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第64-65页 |
| ·重组蛋白的Western-blot检测 | 第65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| 6 猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用 | 第67-76页 |
| ·前言 | 第67-68页 |
| ·材料与方法 | 第68-70页 |
| ·EMCV VP1重组蛋白 | 第68页 |
| ·主要试剂 | 第68页 |
| ·血清 | 第68页 |
| ·间接ELISA方法最佳反应条件的确定 | 第68-69页 |
| ·抗原包被浓度及待检血清稀释度的确定 | 第68页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第68页 |
| ·封闭液的选择 | 第68页 |
| ·待检血清作用时间的确定 | 第68-69页 |
| ·酶标抗体作用时间的确定 | 第69页 |
| ·底物作用时间的确定 | 第69页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第69页 |
| ·特异性试验 | 第69页 |
| ·广西省EMCV感染的血清学调查 | 第69-70页 |
| ·结果 | 第70-74页 |
| ·间接ELISA方法最佳反应条件的确定 | 第70-73页 |
| ·最佳抗原包被浓度及待检血清稀释度的确定 | 第70页 |
| ·酶标抗体最佳工作浓度的确定 | 第70-71页 |
| ·封闭液的选择 | 第71页 |
| ·待检血清最佳作用时间的确定 | 第71-72页 |
| ·酶标抗体作用时间的确定 | 第72页 |
| ·底物最佳作用时间的确定 | 第72-73页 |
| ·阴阳性临界值的确定 | 第73页 |
| ·特异性试验 | 第73页 |
| ·广西省EMCV感染的血清学调查 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-76页 |
| 7 猪脑心肌炎病毒GXLC株的分离及其3D基因分子特征的分析 | 第76-87页 |
| ·前言 | 第76-77页 |
| ·材料与方法 | 第77-79页 |
| ·待检材料 | 第77页 |
| ·主要试剂 | 第77页 |
| ·引物设计 | 第77-78页 |
| ·EMCV的分离和鉴定 | 第78页 |
| ·EMCV的分离 | 第78页 |
| ·EMCV分离株RT-PCR检测 | 第78页 |
| ·EMCV分离株间接荧光抗体试验(IFA) | 第78页 |
| ·EMCV分离株TCID_(50)测定 | 第78页 |
| ·EMCV分离株3D基因核苷酸序列测定 | 第78-79页 |
| ·EMCV分离株3D基因分子特征分析 | 第79页 |
| ·3D蛋白特性分析 | 第79页 |
| ·3D基因同源性分析 | 第79页 |
| ·3D基因系统进化分析 | 第79页 |
| ·结果 | 第79-85页 |
| ·EMCV GXLC株分离与鉴定 | 第79-81页 |
| ·EMCV GXLC株3D基因序列 | 第81-82页 |
| ·EMCV GXLC株3D蛋白特性分析及其抗原表位预测 | 第82页 |
| ·EMCV GXLC株3D基因同源性分析 | 第82-83页 |
| ·EMCV GXLC株3D基因系统进化分析 | 第83-85页 |
| ·讨论 | 第85-87页 |
| 8 猪脑心肌炎病毒GXLC株结构蛋白VP1基因的分子特征 | 第87-96页 |
| ·前言 | 第87-88页 |
| ·材料与方法 | 第88-89页 |
| ·病毒 | 第88页 |
| ·主要试剂 | 第88页 |
| ·引物 | 第88页 |
| ·病毒RNA的提取及RT-PCR | 第88页 |
| ·PCR扩增产物的克隆与VP1因序列的测定 | 第88-89页 |
| ·VP1蛋白特性分析 | 第89页 |
| ·VP1基因同源性分析 | 第89页 |
| ·VP1基因系统进化分析 | 第89页 |
| ·结果 | 第89-93页 |
| ·EMCV VP1基因的PCR扩增及重组质粒鉴定 | 第89-90页 |
| ·EMCV VP1基因序列 | 第90页 |
| ·VP1蛋白特性分析及其抗原表位预测 | 第90-91页 |
| ·VP1基因同源性分析 | 第91-93页 |
| ·VP1基因系统进化分析 | 第93页 |
| ·讨论 | 第93-96页 |
| 9 猪源脑心肌炎病毒GXLC株全基因组序列测定与分析 | 第96-109页 |
| ·前言 | 第96-97页 |
| ·材料与方法 | 第97-100页 |
| ·病毒 | 第97页 |
| ·细胞与载体 | 第97页 |
| ·主要试剂 | 第97页 |
| ·病毒RNA的提取及RT-PCR | 第97-98页 |
| ·PCR扩增产物的克隆与基因组序列测定 | 第98-99页 |
| ·同源性比较 | 第99-100页 |
| ·系统进化分析 | 第100页 |
| ·结果 | 第100-106页 |
| ·GXLC株全基因组的分段扩增、测序及序列拼接 | 第100-101页 |
| ·GXLC株的基因组组成和结构分析 | 第101-102页 |
| ·GXLC株全基因组及各基因片段同源性分析 | 第102-104页 |
| ·GXLC株系统进化分析 | 第104-106页 |
| ·讨论 | 第106-109页 |
| 10 小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第109-127页 |
| ·前言 | 第109-110页 |
| ·材料与方法 | 第110-114页 |
| ·病毒及实验动物 | 第110页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第110-111页 |
| ·引物及探针的设计与合成 | 第111页 |
| ·重组质粒标准品的制备 | 第111-112页 |
| ·Real-time PCR标准曲线的制作 | 第112页 |
| ·Real-time PCR的敏感性试验 | 第112页 |
| ·Real-time PCR的特异性试验 | 第112-113页 |
| ·Real-time PCR的重复性试验 | 第113页 |
| ·Real-time PCR的应用 | 第113-114页 |
| ·结果 | 第114-121页 |
| ·质粒标准品的制备 | 第114页 |
| ·Real-time PCR反应条件的优化 | 第114页 |
| ·Real-time PCR标准曲线的制作 | 第114-116页 |
| ·Real-time PCR的敏感性分析 | 第116页 |
| ·Real-time PCR的特异性分析 | 第116-117页 |
| ·Real-time PCR的重复性分析 | 第117-118页 |
| ·Real-time PCR的应用 | 第118-121页 |
| ·讨论 | 第121-127页 |
| 11 猪IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 | 第127-137页 |
| ·前言 | 第127-128页 |
| ·材料与方法 | 第128-131页 |
| ·病毒及实验动物 | 第128页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第128页 |
| ·引物及探针的设计与合成 | 第128-129页 |
| ·重组质粒标准品的制备 | 第129-130页 |
| ·Real-time PCR标准曲线的制作 | 第130页 |
| ·Real-time PCR的敏感性试验 | 第130页 |
| ·Real-time PCR的特异性试验 | 第130页 |
| ·Real-time PCR的重复性试验 | 第130页 |
| ·Real-time PCR的应用 | 第130-131页 |
| ·结果 | 第131-135页 |
| ·质粒标准品的制备 | 第131页 |
| ·多重real-time PCR反应条件的优化 | 第131-132页 |
| ·多重real-time PCR标准曲线的制作 | 第132页 |
| ·多重real-time PCR的敏感性分析 | 第132页 |
| ·多重real-time PCR的特异性分析 | 第132-133页 |
| ·多重real-time PCR的重复性分析 | 第133页 |
| ·多重real-time PCR的应用 | 第133-135页 |
| ·讨论 | 第135-137页 |
| 12 猪源脑心肌炎病毒GXLC株对小鼠的致病性试验 | 第137-149页 |
| ·前言 | 第137-138页 |
| ·材料与方法 | 第138-141页 |
| ·病毒及实验动物 | 第138页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第138页 |
| ·引物及探针的设计与合成 | 第138-139页 |
| ·EMCV GXLC株半数致死量(LD_(50))的测定 | 第139页 |
| ·小鼠存活曲线的测定 | 第139页 |
| ·小鼠接种试验 | 第139-140页 |
| ·小鼠心重/体重比值的测定 | 第140页 |
| ·组织器官组织病理学检查 | 第140页 |
| ·组织器官及血清中病毒含量的测定 | 第140页 |
| ·血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量的测定 | 第140页 |
| ·组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平的测定 | 第140-141页 |
| ·统计学分析 | 第141页 |
| ·结果 | 第141-147页 |
| ·EMCV GXLC株LD_(50)测定 | 第141页 |
| ·小鼠存活曲线测定 | 第141-142页 |
| ·临床症状和病理变化观察 | 第142-143页 |
| ·小鼠心重/体重比值测定 | 第143-144页 |
| ·组织器官及血清中病毒含量测定 | 第144页 |
| ·血清中IL-1β、TNF-α蛋白含量测定 | 第144-145页 |
| ·组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平测定 | 第145-147页 |
| ·讨论 | 第147-149页 |
| 13 猪源脑心肌炎病毒GXLC株对仔猪的致病性试验 | 第149-160页 |
| ·前言 | 第149-150页 |
| ·材料与方法 | 第150-152页 |
| ·病毒及实验动物 | 第150页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第150页 |
| ·引物及探针的设计与合成 | 第150-151页 |
| ·仔猪接种试验 | 第151页 |
| ·组织器官组织病理学检查 | 第151-152页 |
| ·组织器官及血清中病毒含量的测定 | 第152页 |
| ·血清中和抗体效价的测定 | 第152页 |
| ·组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平的测定 | 第152页 |
| ·统计学分析 | 第152页 |
| ·结果 | 第152-158页 |
| ·感染仔猪临床症状及病理变化观察 | 第152-154页 |
| ·组织器官及血清中病毒含量测定 | 第154-155页 |
| ·中和抗体效价检测 | 第155-156页 |
| ·组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平检测 | 第156-158页 |
| ·讨论 | 第158-160页 |
| 14 结论 | 第160-161页 |
| 参考文献 | 第161-173页 |
| 致谢 | 第173-174页 |
| 博士后期间发表的论文 | 第174-176页 |
| 个人简历 | 第176-177页 |
| 永久通信地址 | 第177页 |
