| 目录 | 第1-6页 |
| 图表目录 | 第6-8页 |
| 中文摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 英文缩略语表 | 第11-13页 |
| 序言 | 第13-14页 |
| 第一部分 SARS冠状病毒刺突蛋白的表达纯化和致病机理研究 | 第14-83页 |
| 前言 | 第15-25页 |
| 1 实验材料 | 第25-34页 |
| ·质粒 | 第25页 |
| ·菌株 | 第25-26页 |
| ·细胞株 | 第26页 |
| ·实验动物 | 第26页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA分子量标记 | 第26页 |
| ·主要化学试剂 | 第26-27页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第27页 |
| ·试剂盒 | 第27页 |
| ·主要仪器及设备 | 第27-28页 |
| ·主要溶液配方 | 第28-32页 |
| ·主要PCR引物的序列 | 第32-33页 |
| ·主要抗体 | 第33-34页 |
| 2 实验方法 | 第34-49页 |
| ·单链复性 | 第34页 |
| ·PCR实验 | 第34-35页 |
| ·酶切消化 | 第35页 |
| ·DNA片段连接 | 第35-36页 |
| ·转化 | 第36页 |
| ·质粒扩增和鉴定 | 第36页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第37页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第37-39页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第39页 |
| ·构建恒定表达细胞株的质粒酶切和纯化 | 第39页 |
| ·贴壁细胞培养和传代 | 第39页 |
| ·细胞冻存 | 第39-40页 |
| ·细胞复苏 | 第40页 |
| ·恒定表达细胞株的构建 | 第40页 |
| ·细胞裂解 | 第40-41页 |
| ·ELISA检测方法(参考BD ELISA试剂盒说明) | 第41页 |
| ·Western Blotting的检测方法 | 第41-43页 |
| ·用流式细胞技术检测表达蛋白的活性 | 第43页 |
| ·蛋白纯化 | 第43-44页 |
| ·Spike蛋白S1190-Fc与ACE2的IP实验 | 第44页 |
| ·S1190-Fc导致细胞表面受体ACE2表达下调实验 | 第44-45页 |
| ·细胞融合实验 | 第45页 |
| ·小鼠肺弹性变化分析方法 | 第45-46页 |
| ·肺损伤评分方法 | 第46页 |
| ·小鼠肺组织湿干重分析方法 | 第46-47页 |
| ·免疫组化染色 | 第47页 |
| ·S1190-Fc免疫后血清中中和抗体的滴度检测 | 第47-48页 |
| ·SARS-CoV感染导致小鼠肺部组织ACE2表达下调实验 | 第48-49页 |
| 3 实验结果 | 第49-70页 |
| ·合成优化后的SARS-CoV Spike蛋白的全基因 | 第49-51页 |
| ·将CD5L插入载体Peak13 humanIgG-Fc | 第51-52页 |
| ·将Spike蛋白及其突变体基因克隆到P13 CD5L-Fc中 | 第52-53页 |
| ·用得到的质粒瞬转细胞,检测蛋白的表达 | 第53页 |
| ·质粒大提 | 第53页 |
| ·恒定表达细胞株的构建 | 第53-54页 |
| ·恒定表达细胞株表达产物的定性与定量 | 第54-55页 |
| ·蛋白提纯 | 第55-56页 |
| ·融合蛋白的活性检测 | 第56-58页 |
| ·S1190-Fc与ACE2的免疫共沉淀(IP)实验结果 | 第58-59页 |
| ·受体ACE2下调实验 | 第59-61页 |
| ·细胞融合实验 | 第61-62页 |
| ·肺弹性变化分析 | 第62-64页 |
| ·S1190-Fc处理酸灌注小鼠肺组织湿干重量比 | 第64-65页 |
| ·S1190-Fc处理肺损伤小鼠肺组织病理切片,肺损伤评分和免疫组化 | 第65-68页 |
| ·SARS-CoV感染及S1190-Fc处理后小鼠肺组织ACE2表达下调 | 第68-69页 |
| ·S1190-Fc免疫小鼠后血清中中和抗体的滴度检测 | 第69-70页 |
| 讨论 | 第70-77页 |
| 小结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 第二部分 H5N1型禽流感病毒致病机理研究 | 第83-129页 |
| 前言 | 第84-89页 |
| 1 实验材料 | 第89-91页 |
| ·质粒 | 第89页 |
| ·菌株 | 第89页 |
| ·细胞株 | 第89页 |
| ·实验动物 | 第89页 |
| ·病毒株 | 第89页 |
| ·主要生化试剂 | 第89-90页 |
| ·主要仪器及设备 | 第90页 |
| ·主要溶液配制 | 第90页 |
| ·主要PCR引物序列 | 第90-91页 |
| 2 实验方法 | 第91-97页 |
| ·H5N1型禽流感病毒的表面膜蛋白H5的表达和纯化 | 第91页 |
| ·H5N1型禽流感病毒诱导细胞产生autophagy的实验 | 第91-92页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒诱导细胞产生autophagy的实验 | 第92-93页 |
| ·重组的H5蛋白诱导细胞产生autophagy的电镜实验 | 第93-94页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒和H5蛋白诱导细胞后LC3的凝集变化 | 第94页 |
| ·灭活H5N1型禽病毒感染A549细胞后蛋白表达水平的变化 | 第94-95页 |
| ·抑制p38或tsc2基因表达后灭活H5N1病毒引起A549细胞蛋白表达变化 | 第95页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺损伤和重组H5蛋白加重小鼠肺损伤 | 第95-97页 |
| 3 实验结果 | 第97-121页 |
| ·Peak13CD5L-H5-TEV-humanIgG的质粒酶切鉴定图 | 第97页 |
| ·Peak13CD5L-H5-TEV-humanIgG转染细胞的结果 | 第97-98页 |
| ·H5-Fc蛋白纯化及TEV酶处理后的SDS—PAGE电泳结果 | 第98页 |
| ·H5N1型禽流感病毒诱导细胞产生autophagy的结果 | 第98-101页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒诱导细胞产生autophagy结果 | 第101-103页 |
| ·重组H5蛋白诱导细胞产生autophagy的结果 | 第103-105页 |
| ·Rapamycin诱导细胞产生autophagy的结果 | 第105-108页 |
| ·灭活H5N1病毒和H5蛋白处理转染EGFP-LC3的细胞后LC3变化 | 第108-112页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒诱导A549细胞蛋白表达水平变化的结果 | 第112-115页 |
| ·过量灭活H5N1病毒造成A549细胞死亡的MTT实验 | 第115-116页 |
| ·灭活H5N1病毒和重组H5蛋白诱导和加重小鼠肺损伤的实验结果 | 第116-121页 |
| 讨论 | 第121-124页 |
| 小结 | 第124-125页 |
| 参考文献 | 第125-129页 |
| 个人简历 | 第129-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
