| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 前言 | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-48页 |
| 第一部分 日本脑炎病毒研究进展 | 第15-42页 |
| 1 概述 | 第15页 |
| 2 病原学 | 第15-17页 |
| ·理化特性 | 第15-16页 |
| ·抗原性 | 第16页 |
| ·致病性 | 第16-17页 |
| ·血凝特性 | 第17页 |
| ·培养特性 | 第17页 |
| 3 持续性感染 | 第17-18页 |
| 4 流行病学 | 第18-20页 |
| ·传染源 | 第19页 |
| ·传播媒介 | 第19页 |
| ·易感动物 | 第19-20页 |
| ·分布和季节 | 第20页 |
| 5 分子生物学 | 第20-29页 |
| ·病毒的结构 | 第20-21页 |
| ·病毒基因组的结构 | 第21页 |
| ·JEV生物合成 | 第21-22页 |
| ·病毒结构基因编码的蛋白 | 第22-27页 |
| ·分子毒力机制 | 第27-29页 |
| 6 病理及致病机理 | 第29-32页 |
| ·病理 | 第29页 |
| ·发病机理 | 第29-30页 |
| ·脑炎发病与抗病机制 | 第30-32页 |
| 7 诊断方法 | 第32-36页 |
| ·病毒分离鉴定 | 第33页 |
| ·病原学检查 | 第33-34页 |
| ·血清学检测方法 | 第34-36页 |
| 8 疫苗 | 第36-42页 |
| ·灭活疫苗 | 第37-38页 |
| ·减毒活疫苗 | 第38页 |
| ·发展中的乙脑疫苗 | 第38-42页 |
| ·展望 | 第42页 |
| 第二部分 伪狂犬病病毒活载体疫苗的研究进展 | 第42-47页 |
| 1 伪狂犬病毒载体的优越性 | 第43页 |
| 2 重组伪狂犬病毒的构建策略 | 第43-44页 |
| 3 外源基因在重组伪狂犬病毒中的表达及生物学活性 | 第44-45页 |
| 4 重组疫苗的安全性、应用前景及存在的问题 | 第45-47页 |
| 研究的目的和意义 | 第47-48页 |
| 第二章 PRV-JE二联基因工程疫苗的研究 | 第48-76页 |
| 1 实验材料 | 第48-51页 |
| ·毒种与细胞 | 第48页 |
| ·菌种与质粒 | 第48页 |
| ·研究中所用的引物 | 第48-49页 |
| ·主要的药品及试剂 | 第49页 |
| ·主要培养基 | 第49-50页 |
| ·质粒小量抽提液 | 第50页 |
| ·碱裂解法质粒提取试剂及纯化用缓冲液 | 第50页 |
| ·SDS-PAGE缓冲液 | 第50页 |
| ·Western blotting缓冲液 | 第50-51页 |
| ·其它缓冲液 | 第51页 |
| 2 实验方法 | 第51-60页 |
| ·质粒的小量制备 | 第51页 |
| ·碱裂解法质粒提取与纯化 | 第51-52页 |
| ·感受态细胞制备 | 第52-53页 |
| ·伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.PrM(PPM)和pPI-2.EGFP.E(PPE)的构建 | 第53-60页 |
| 3 结果 | 第60-71页 |
| ·JEV PrM和E基因的扩增、克隆与鉴定 | 第60-62页 |
| ·JEV-E、PrM基因的序列测定 | 第62页 |
| ·伪狂犬转移载体pPI-2.EGFP.E及pPI-2.EGFP.PrM的构建及鉴定 | 第62-64页 |
| ·重组伪狂犬病毒SA215(E)和SA215(F)的构建与筛选 | 第64-66页 |
| ·重组病毒的SA215(E)、(F)PCR鉴定 | 第66-69页 |
| ·重组病毒SA215(E)和SA215(F)的Southern杂交鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组病毒SA215(E)及SA215(F)Western-bloting检侧 | 第70-71页 |
| 4.讨论 | 第71-75页 |
| ·乙脑病毒E基因和PrM基因的选择 | 第72页 |
| ·伪狂犬病病毒载体的选择 | 第72-73页 |
| ·重组伪狂犬病病毒SA215(E)及(F)的构建 | 第73-74页 |
| ·关于真核转染宿主细胞的选择 | 第74页 |
| ·重组伪狂犬病毒SA215(E)和SA215(F)的筛选 | 第74页 |
| ·外源基因在伪狂犬病病毒载体中的表达 | 第74-75页 |
| 5 小结 | 第75-76页 |
| 第三章 SA215(E)及SA215(F)部分生物学特性研究 | 第76-88页 |
| 1 材料 | 第76页 |
| ·疫苗和病毒 | 第76页 |
| ·细胞 | 第76页 |
| ·试剂 | 第76页 |
| ·实验动物 | 第76页 |
| 2 方法 | 第76-79页 |
| ·细胞培养 | 第76-77页 |
| ·在Vero细胞上的致病效应观察 | 第77页 |
| ·蚀斑试验 | 第77页 |
| ·一步生长曲线测定 | 第77页 |
| ·重组病毒与亲本毒株SA215形态学比较 | 第77页 |
| ·稳定性试验 | 第77-78页 |
| ·新生仔猪安全试验 | 第78页 |
| ·重组病毒对Balb/c小鼠和兔的安全性 | 第78页 |
| ·重组病毒对小鼠免疫保护性试验 | 第78页 |
| ·重组病毒对兔的免疫保护性试验 | 第78页 |
| ·接种SA215(E)、SA215(F)鼠血清JEV中和抗体检测 | 第78页 |
| ·外周T淋巴细胞亚群数量的检测 | 第78-79页 |
| ·脾淋巴细胞增殖反应试验 | 第79页 |
| 3 结果 | 第79-85页 |
| ·SA215(E)和SA215(F)在Vero细胞上致病变效应过程 | 第79-80页 |
| ·噬斑形态观察 | 第80页 |
| ·一步生长曲线 | 第80-81页 |
| ·重组病毒SA215(E)、(F)与亲本毒株SA215形态学比较 | 第81-82页 |
| ·稳定性试验 | 第82页 |
| ·安全性试验结果 | 第82-83页 |
| ·重组病毒对伪狂犬病的免疫保护性试验结果 | 第83页 |
| ·重组病毒对乙脑病毒的免疫保护性试验结果 | 第83页 |
| ·中和试验结果 | 第83-84页 |
| ·免疫小鼠T细胞亚群数量的变化 | 第84页 |
| ·免疫小鼠的脾特异性淋巴细胞增值反应检测 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-87页 |
| ·外源基因插入对PRV培养特性的影响 | 第85页 |
| ·重组病毒稳定性 | 第85-86页 |
| ·关于SA215(E)及SA215(F)株安全性 | 第86页 |
| ·关于重组病毒免疫原性 | 第86-87页 |
| 5 小结 | 第87-88页 |
| 第四章 NS1及NS3原核表达 | 第88-106页 |
| 1 实验材料 | 第88-91页 |
| ·主要仪器 | 第88页 |
| ·菌株、载体 | 第88页 |
| ·主要药品与试剂 | 第88-89页 |
| ·NS1及NS3引物 | 第89页 |
| ·主要溶液的配制 | 第89-91页 |
| 2 实验方法 | 第91-98页 |
| ·JEV细胞培养 | 第91页 |
| ·RNA提取 | 第91页 |
| ·乙脑病毒NS1、NS3基因的扩增 | 第91-92页 |
| ·JEV NS1和NS3基因的克隆 | 第92页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第92-94页 |
| ·pET-32(+)NS1和NS3表达菌株的构建 | 第94-95页 |
| ·重组表达质粒的小量诱导表达 | 第95-96页 |
| ·融合蛋白的Western Blot分析 | 第96页 |
| ·重组质粒表达条件的优化 | 第96-97页 |
| ·重组表达蛋白在宿主菌中的分布 | 第97页 |
| ·重组表达蛋白NS1的纯化 | 第97-98页 |
| 3 结果 | 第98-104页 |
| ·JEV NS1、NS3基因的扩增、克隆与鉴定 | 第98-99页 |
| ·JEV-NS1、NS3基因的序列测定 | 第99页 |
| ·重组表达载体pET-32a(+)NS1和NS3的构建及鉴定 | 第99-100页 |
| ·重组质粒的小量诱导表达 | 第100-101页 |
| ·重组表达蛋白在宿主菌中的分布 | 第101页 |
| ·表达产物的Western blot分析 | 第101-102页 |
| ·重组质粒pET-NS1表达条件的优化 | 第102-103页 |
| ·NS1融合蛋白的纯化 | 第103-104页 |
| 4 讨论 | 第104-105页 |
| ·重组蛋白表达载体的选择 | 第104页 |
| ·关于包涵体和包涵体溶解 | 第104-105页 |
| ·关于重组蛋白的纯化 | 第105页 |
| 5 小结 | 第105-106页 |
| 第五章 重组蛋白NS1间接ELISA方法的初步建立 | 第106-115页 |
| 1 材料 | 第106-107页 |
| ·制备抗原所需材料 | 第106页 |
| ·试验用血清 | 第106页 |
| ·主要仪器设备及耗材 | 第106页 |
| ·ELISA试剂和溶液 | 第106-107页 |
| 2 方法 | 第107-109页 |
| ·ELISA抗原的制备 | 第107页 |
| ·间接ELISA操作程序 | 第107-109页 |
| 3 结果 | 第109-112页 |
| ·抗原和抗体最佳浓度的确 | 第109页 |
| ·最适封闭液的确定 | 第109页 |
| ·血清最适结合时间的确定 | 第109-110页 |
| ·酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定 | 第110页 |
| ·底物作用时间的确定 | 第110-111页 |
| ·间接ELISA方法阴阳性临界值的确定 | 第111页 |
| ·特异性试验 | 第111-112页 |
| ·重复性试验 | 第112页 |
| ·试验血清检测结果 | 第112页 |
| 4 讨论 | 第112-114页 |
| ·间接ELISA方法在JEV检测诊断中的应用 | 第112-113页 |
| ·包被抗原 | 第113页 |
| ·酶标抗体 | 第113页 |
| ·特异性和重复性分析 | 第113-114页 |
| ·关于该方法用于鉴别诊断的可行性 | 第114页 |
| 5.小结 | 第114-115页 |
| 结论 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 个人简介 | 第130页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第130页 |
