| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-42页 |
| 1.概述 | 第12-13页 |
| 2.与细胞信号传导相关的蛋白质酶类 | 第13-16页 |
| 3.丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白质磷酸酶 | 第16-30页 |
| ·蛋白质磷酸酶1(PP-1) | 第17-24页 |
| ·蛋白质磷酸酶2A(PP-2A) | 第24-29页 |
| ·蛋白质磷酸酶2B(PP-2B) | 第29页 |
| ·蛋白质磷酸酶2C(PP-2C) | 第29页 |
| ·其它蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PP-X) | 第29-30页 |
| 4.转录因子Pax-6 | 第30-42页 |
| ·Pax-6在晶体发育中的功能 | 第30-33页 |
| ·Pax-6作为转录因子的功能 | 第33-37页 |
| ·Pax-6的磷酸化与脱磷酸化调节 | 第37-42页 |
| 第二章 各种试剂的配制及实验方法 | 第42-52页 |
| 1.各种试剂的配制 | 第42-46页 |
| 2.各种实验方法 | 第46-52页 |
| 第三章 PP-1与PP-2A能在体外反应中使Pax-6脱磷酸化 | 第52-65页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第52页 |
| 2.实验部分 | 第52-65页 |
| ·GST融合蛋白的制备 | 第52-56页 |
| ·GST融合蛋白的体外放射性同位素标记 | 第56-57页 |
| ·体外脱磷酸化反应 | 第57-58页 |
| ·实验结果 | 第58-65页 |
| 第四章 PP-1的催化亚基能在体内与Pax-6结合成复合体 | 第65-79页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第65页 |
| 2.实验部分 | 第65-79页 |
| ·pCI-neo-hPax-6表达载体的构建 | 第65-66页 |
| ·在人类晶体上皮细胞中稳定转染pCI-neo-hPax-6以及高表达hPax-6克隆的筛选 | 第66-67页 |
| ·细胞培养及UVA处理 | 第67-68页 |
| ·总蛋白的抽提以及免疫沉降 | 第68-69页 |
| ·Calyculin A处理细胞以及免疫沉降反应 | 第69页 |
| ·实验结果 | 第69-79页 |
| 第五章 PP-1α能够在体内使Pax-6脱磷酸化,而过表达PP-1α则导致Pax-6的脱磷酸化状态增强 | 第79-88页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第79页 |
| 2.实验部分 | 第79-88页 |
| ·pCI-neo-PP-1α表达载体的构建 | 第79-80页 |
| ·在人类晶体上皮细胞中稳定转染pCI-neo-PP-1α以及高表达PP-1α克隆的筛选 | 第80-81页 |
| ·体内脱磷酸化实验 | 第81-82页 |
| ·Western blot检测PP-1α的表达对Pax-6磷酸化状态的影响 | 第82页 |
| ·实验结果 | 第82-88页 |
| 第六章 Calyculin A对PP-1α的抑制作用能增强Pax-6的磷酸化 | 第88-95页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第88页 |
| 2.实验部分 | 第88-95页 |
| ·Calyculin A对pCI-neo-HLE和pCI-PP-1α-HLE两种细胞的处理 | 第88页 |
| ·不同浓度Calyculin A对pCI-hPax-6-HLE处理 | 第88-89页 |
| ·实验结果 | 第89-95页 |
| 第七章 特异性siRNA对PP-1α和PP-1β进行Knock-down,能引起Pax-6的高磷酸化 | 第95-107页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第95页 |
| 2.实验部分 | 第95-107页 |
| ·高表达hPax-6的HLE的细胞培养以及特异性siRNAs对PP-1α,PP-1β和PP-2Aα进行Knock-down的实验 | 第95-96页 |
| ·Total RNA的抽提以及浓度测定 | 第96页 |
| ·反转录PCR实验与Western blot杂交实验 | 第96-97页 |
| ·实验结果 | 第97-107页 |
| 第八章 Pax-6的持续磷酸化突变或者持续脱磷酸化突变能调节其功能 | 第107-126页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第107页 |
| 2.实验部分 | 第107-126页 |
| ·pCI-Neo-hPax-6(TS360-361AA)和pCI-Neo-hPax-6(TS360-361DD)突变体表达载体的构建 | 第107-113页 |
| ·在人类晶体上皮细胞中稳定转染pCI-neo-hPax-6(TS360-361AA)和pCI-Neo-hPax-6(TS360-361DD)突变体以及高表达hPax-6突变体克隆的筛选 | 第113-115页 |
| ·Total RNA的抽提以及浓度测定 | 第115页 |
| ·反转录PCR实验以及Pax-6下游基因αB-crystallin的表达差异与Western blot杂交实验 | 第115-116页 |
| ·实验结果 | 第116-126页 |
| 第九章 PP-1对Pax-6转录功能的负调节 | 第126-135页 |
| 1.化学试剂与仪器 | 第126页 |
| 2.实验部分 | 第126-135页 |
| ·pGL-αB-Luc报告基因载体的构建 | 第126-128页 |
| ·pCI-Neo-PP-2Aα表达载体的构建 | 第128-129页 |
| ·双荧光报告基因系统对兔晶体上皮细胞(N/N1003A)和鼠晶体上皮细胞(αTN4-1)的瞬时转染 | 第129页 |
| ·双荧光系统中荧光的测定 | 第129-130页 |
| ·高表达hPax-6的HLE的细胞培养以及特异性siRNAs对PP-10α,PP-1β和PP-2Aα进行Knock-down实验 | 第130页 |
| ·Total RNA的抽提以及浓度测定 | 第130-131页 |
| ·不同siRNA处理时,反转录PCR实验以及Pax-6下游基因αB-crystallin的表达差异 | 第131页 |
| ·实验结果 | 第131-135页 |
| 第十章 讨论 | 第135-139页 |
| 1.在人类晶体上皮细胞中,PP-1是使Pax-6脱磷酸化的主要蛋白质磷酸酶 | 第136-137页 |
| 2.蛋白质的脱磷酸化调节是一个分子开关 | 第137-139页 |
| 参考文献 | 第139-163页 |
| 致谢 | 第163-165页 |
| 附录 | 第165-168页 |
