| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 前言 | 第14-34页 |
| 1.核定位是β-珠蛋白基因簇表达调控研究的新领域 | 第14-19页 |
| ·β-珠蛋白基因簇的表达受DNA,染色质和核定位三个水平的综合调控 | 第14-18页 |
| ·核定位变化往往是β-珠蛋白基因簇活化的第一步 | 第18-19页 |
| 2.基因在细胞核内的空间分布及其定位变化对基因表达有调控作用 | 第19-29页 |
| ·细胞核内结构是有序排布的 | 第19-20页 |
| ·基因在细胞核内的定位与其表达状况密切相关 | 第20-25页 |
| ·核定位是有组织特异性,发育阶段特异性和动态调控性的 | 第20-21页 |
| ·基因相对于其所在染色体区域的定位:CT-IC模型 | 第21-23页 |
| ·基因相对于核基质的定位与其表达之间的关系 | 第23-25页 |
| ·多种因素参与基因核定位的调控 | 第25-29页 |
| ·顺式作用元件通过不同结合状态调控基因核定位 | 第25-26页 |
| ·反式作用因子通过自身的修饰与移位介导基因核定位 | 第26-27页 |
| ·核基质通过参与核结构的排布调控相关基因的核定位 | 第27-29页 |
| 3.SATB1蛋白是重要的核基质结合蛋白 | 第29-32页 |
| ·SATB蛋白可相互聚合形成依赖于核基质的笼形结构 | 第29-31页 |
| ·SATB1可以通过介导与核基质结合调控相关基因表达 | 第31-32页 |
| ·SATB1可在染色质水平调控β-珠蛋白基因的表达 | 第32页 |
| 4.本实验研究内容 | 第32-34页 |
| 材料与方法 | 第34-55页 |
| 一.实验材料 | 第34-36页 |
| 1.菌株与质粒 | 第34页 |
| 2.细胞系 | 第34-35页 |
| 3.限制性内切酶及修饰酶 | 第35页 |
| 4.试剂盒 | 第35页 |
| 5.抗体 | 第35页 |
| 6.其它主要试剂 | 第35-36页 |
| 7.引物合成 | 第36页 |
| 8.主要仪器设备 | 第36页 |
| 二.实验方法 | 第36-55页 |
| 1.研究的基本技术路线 | 第36-37页 |
| 2.细胞的培养 | 第37-38页 |
| ·细胞培养条件 | 第37-38页 |
| ·细胞传代 | 第38页 |
| ·细胞的复苏和冻存 | 第38页 |
| 3.SATB1及其突变表达的载体构建 | 第38-43页 |
| ·载体构建技术路线 | 第38-39页 |
| ·质粒的小量制备--碱裂解法 | 第39-40页 |
| ·插入片段PCR扩增的引物设计及扩增条件 | 第40页 |
| ·凝胶回收PCR产物 | 第40页 |
| ·PCR产物末端加A后与T载体连接 | 第40-41页 |
| ·载体去磷酸化 | 第41页 |
| ·连接 | 第41-42页 |
| ·转化 | 第42-43页 |
| ·感受态E.coli DH5α的制备 | 第42页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第42页 |
| ·感受态细胞的快速转化 | 第42-43页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第43页 |
| ·PCR鉴定插入片段 | 第43页 |
| ·酶切鉴定插入片段及插入方向 | 第43页 |
| ·测序鉴定插入片段 | 第43页 |
| 4.转染 | 第43-44页 |
| 5.半定量RT-PCR及Western Blotting检测SATB1表达 | 第44-48页 |
| ·半定量RT-PCR检测SATB1表达 | 第44-45页 |
| ·总RNA提取 | 第44页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第44-45页 |
| ·总SATB1mRNA检测引物的设计及扩增条件 | 第45页 |
| ·外源SATB1mRNA检测引物的设计及扩增条件 | 第45页 |
| ·突变SATB1mRNA检测引物的设计及扩增条件 | 第45页 |
| ·Western Blot分析 | 第45-48页 |
| ·裂解细胞 | 第45页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第45-46页 |
| ·BCA法测定蛋白质浓度的实验原理 | 第45-46页 |
| ·实验步骤 | 第46页 |
| ·SDS-PAGE | 第46页 |
| ·转膜 | 第46-47页 |
| ·抗原抗体反应 | 第47页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法 | 第47-48页 |
| 6.半定量RT-PCR检测β-类珠蛋白基因的表达水平 | 第48页 |
| ·总RNA提取 | 第48页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第48页 |
| ·引物设计及扩增条件 | 第48页 |
| 7.DNA FISH检测珠蛋白基因簇相对于11号染色体区域的定位 | 第48-51页 |
| ·探针的制备 | 第48-49页 |
| ·细胞的低渗处理,固定及滴片 | 第49-50页 |
| ·玻片的预处理 | 第50页 |
| ·探针预变性 | 第50页 |
| ·杂交 | 第50页 |
| ·洗片 | 第50页 |
| ·DAPI复染及荧光显微镜观察 | 第50-51页 |
| 8.观察珠蛋白基因簇相对于核基质的定位 | 第51-52页 |
| ·核晕的制备 | 第51页 |
| ·细胞准备及甩片 | 第51页 |
| ·含0.5%Triton100的CSK buffer处理 | 第51页 |
| ·2M NaCl buffer处理 | 第51页 |
| ·洗片及系列脱水 | 第51页 |
| ·烤片 | 第51页 |
| ·DNA FISH检测珠蛋白基因簇相对于核基质的定位 | 第51-52页 |
| ·玻片预处理 | 第51-52页 |
| ·探针预变性 | 第52页 |
| ·杂交 | 第52页 |
| ·洗片 | 第52页 |
| ·DAPI复染及荧光显微镜观察 | 第52页 |
| 9.染色质免疫共沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP) | 第52-55页 |
| ·固定细胞 | 第52页 |
| ·全细胞抽提物(whole-cell extract,WCE)的获得 | 第52页 |
| ·免疫共沉淀 | 第52-53页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第53页 |
| ·半定量PCR反应 | 第53-55页 |
| 实验结果 | 第55-73页 |
| 1.SATB1/K562,mSATB1/K562稳定克隆细胞株的建立 | 第55-58页 |
| ·SATB1过表达载体的构建 | 第55-56页 |
| ·PCR扩增SATB1编码序列 | 第55-56页 |
| ·酶切鉴定 | 第56页 |
| ·测序鉴定 | 第56页 |
| ·突变SATB1表达载体的构建 | 第56-58页 |
| ·核基质结合区域前后两段序列的分别扩增 | 第56-57页 |
| ·两段序列退火连接 | 第57页 |
| ·PCR扩增突变的SATB1表达序列 | 第57页 |
| ·测序鉴定 | 第57-58页 |
| 2.SATB1/K562,mSATB1/K562稳定克隆细胞株的建立 | 第58-61页 |
| ·荧光观察 | 第58页 |
| ·SATB1的表达检测 | 第58-61页 |
| ·mRNA水平检测 | 第58-60页 |
| ·总SATB1 mRNA水平检测 | 第58-59页 |
| ·外源SATB1 mRNA水平检测 | 第59-60页 |
| ·正常及突变SATB1 mRNA水平检测 | 第60页 |
| ·Westen Blot检测SATB1蛋白水平的表达 | 第60-61页 |
| 3.半定量RT-PCR检测β-类珠蛋白基因的表达水平 | 第61-62页 |
| 4.DNA-FISH检测珠蛋白基因簇相对于11号染色体区域的定位 | 第62-66页 |
| ·BAC探针的制备 | 第63页 |
| ·观察β-珠蛋白基因簇环出11号染色体区域的比例 | 第63-66页 |
| 5.检测β-珠蛋白基因簇相对于核基质的定位 | 第66-68页 |
| ·核晕的制备 | 第66-67页 |
| ·观察β-珠蛋白基因簇相对于核基质的定位 | 第67-68页 |
| 6.ChIP检测珠蛋白基因簇与重要调控因子的结合状态 | 第68-73页 |
| ·超声粉碎核抽提物 | 第69页 |
| ·β-珠蛋白基因簇与Pol Ⅱ的结合状态 | 第69-70页 |
| ·β-珠蛋白基因簇与GATA1的结合状态 | 第70-73页 |
| 讨论 | 第73-90页 |
| 1.K562细胞是发育早期分化早期的红白血病细胞 | 第73-74页 |
| 2.SATB1对于β-类珠蛋白基因的调控作用可能依赖于核基质 | 第74-76页 |
| 3.SATB1可以通过改变珠蛋白基因簇在核内的定位调控珠蛋白基因的表达 | 第76-82页 |
| ·正常和突变的SATB1蛋白都可以促使珠蛋白基因簇环出11号染色体区域 | 第76-77页 |
| ·正常和突变的SATB1蛋白造成的珠蛋白基因簇的环出是不同的 | 第77-80页 |
| ·两种情况下的环出与核基质之间的关系并不相同 | 第77-78页 |
| ·两种情况下环出的珠蛋白基因簇与反式作用因子结合的状况不同 | 第78-80页 |
| ·正常与突变SATB1蛋白过表达引导珠蛋白基因簇环出的可能原因分析 | 第80-82页 |
| 4.SATB1调控珠蛋白基因表达的可能机制分析 | 第82-85页 |
| ·SATB1过表达引导β-珠蛋白基因簇环出染色体区域并与核基质结合 | 第82-83页 |
| ·LCR和ε基因是珠蛋白基因簇与SATB1鸟笼结构以及核基质结合的锚定点 | 第83-84页 |
| ·在K562细胞中过表达SATB1对于β-珠蛋白基因簇调控的可能机制 | 第84-85页 |
| 5.环出染色体区域是基因表达的必要非充分条件 | 第85-87页 |
| ·实验证明突变SATB1介导下的珠蛋白基因簇的环出未能起有效的调控作用 | 第85-86页 |
| ·以往实验证实环出的基因簇可能接近异染色质区 | 第86页 |
| ·多个内对照结合研究更能准确表现基因核定位对基因表达的调控功能 | 第86-87页 |
| 6.本研究的创新性 | 第87-88页 |
| ·本实验首次在核定位水平阐述了SATB1对β-珠蛋白基因簇的调控 | 第87-88页 |
| ·本实验首次阐述了核基质与β-珠蛋白基因簇调控的关系 | 第88页 |
| 7.关于进一步实验的设想和展望 | 第88-90页 |
| ·在染色质水平进一步分析SATB1对于β-珠蛋白基因簇的调控 | 第88页 |
| ·观察其它MAR结合蛋白对于β-珠蛋白基因簇的调控机制 | 第88-90页 |
| 小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
| 文献综述 | 第97-112页 |
| REFERENCES | 第106-112页 |
| 缩略词表 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 个人简历 | 第114-117页 |
| 附录1 | 第117-118页 |
| 附录2 | 第118页 |
