| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-8页 |
| 1 前言 | 第8-20页 |
| ·β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸 | 第8-11页 |
| ·克拉维酸产生菌 | 第8-9页 |
| ·克拉维酸抑酶机制 | 第9页 |
| ·克拉维酸的检测 | 第9-11页 |
| ·高效液相色谱法 | 第10页 |
| ·紫外分光光度法 | 第10-11页 |
| ·生物检测法 | 第11页 |
| ·提高棒状链霉菌克拉维酸产量的途径 | 第11-16页 |
| ·与克拉维酸有关的棒状链霉菌的分子生物学研究进展 | 第11-15页 |
| ·克拉维酸的生物合成途径 | 第11-13页 |
| ·克拉维酸的基因调控 | 第13-15页 |
| ·提高克拉维酸产量的遗传学策略 | 第15-16页 |
| ·经典遗传学技术提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究 | 第15页 |
| ·基因工程的方法提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究 | 第15-16页 |
| ·链霉菌的基因转移系统 | 第16-18页 |
| ·链霉菌原生质体的转化 | 第16-17页 |
| ·转化的影响因素 | 第17页 |
| ·转化的研究进展 | 第17-18页 |
| ·本课题研究目的和研究内容 | 第18-20页 |
| ·研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| ·研究的主要内容 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-35页 |
| ·实验材料 | 第20-25页 |
| ·菌种及质粒 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20-21页 |
| ·工具酶及标准蛋白 | 第21-22页 |
| ·抗生素 | 第22页 |
| ·主要仪器 | 第22-23页 |
| ·培养基及溶液 | 第23-25页 |
| ·培养基 | 第23-24页 |
| ·溶液 | 第24-25页 |
| ·实验方法 | 第25-35页 |
| ·菌体培养条件 | 第25页 |
| ·克拉维酸的分析方法 | 第25-27页 |
| ·高效液相色谱检测法 | 第26页 |
| ·紫外分光光度检测法 | 第26-27页 |
| ·生物检测法 | 第27页 |
| ·大肠杆菌中质粒DNA的小量制备 | 第27-28页 |
| ·棒状链霉菌染色体DNA的提取 | 第28页 |
| ·PCR扩增目的基因 | 第28-29页 |
| ·PCR引物的设计 | 第28页 |
| ·PCR扩增lat基因 | 第28-29页 |
| ·DNA片段的体外重组 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pUCm-T-lat的构建 | 第29页 |
| ·重组质粒pKC1139-lat的构建 | 第29-30页 |
| ·lat基因互补缺失的重组质粒pKCLHS、pKCLES的构建 | 第30页 |
| ·质粒DNA对大肠杆菌的转化 | 第30-31页 |
| ·氯化钙转化法 | 第30-31页 |
| ·电击转化 | 第31页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第31-32页 |
| ·棒状链霉菌孢子悬浮液的制备 | 第32页 |
| ·活菌计数测定孢子悬浮液浓度 | 第32页 |
| ·棒状链霉菌原生质体的制备 | 第32-33页 |
| ·棒状链霉菌原生质体再生率的测定 | 第33页 |
| ·质粒转化棒状链霉菌原生质体 | 第33-34页 |
| ·快速小量转化法 | 第33页 |
| ·标准转化法 | 第33-34页 |
| ·棒状链霉菌质粒的小量提取 | 第34页 |
| ·棒状链霉菌质粒的大量提取 | 第34-35页 |
| 3 结果与讨论 | 第35-58页 |
| ·棒状链霉菌生理及生物学特性 | 第35-36页 |
| ·棒状链霉菌的生理特性 | 第35页 |
| ·克拉维酸的生物活性 | 第35-36页 |
| ·棒状链霉菌的发酵培养 | 第35页 |
| ·克拉维酸的体外抑菌活性 | 第35-36页 |
| ·克拉维酸分析方法的确定 | 第36-42页 |
| ·高效液相检测法 | 第36-37页 |
| ·紫外分光光度法 | 第37-39页 |
| ·生物检测法 | 第39-40页 |
| ·三种分析测定方法的比较 | 第40-42页 |
| ·重组质粒pKCLHS、pKCLES的构建 | 第42-51页 |
| ·重组质粒pKCLES、pKCLHS构建流程 | 第42-43页 |
| ·棒状链霉菌lat基因的扩增 | 第43-44页 |
| ·棒状链霉菌染色体DNA的提取 | 第43页 |
| ·PCR扩增lat基因 | 第43-44页 |
| ·重组质粒pUCm-T-lat的构建 | 第44-48页 |
| ·目的基因与pUCm-T载体的连接 | 第44-45页 |
| ·重组质粒pUCm-T-lat转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定 | 第45-48页 |
| ·重组质粒pKC1139-lat的构建 | 第48-49页 |
| ·目的基因与pKC1139载体的连接 | 第48-49页 |
| ·重组质粒pKC1139-lat转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定 | 第49页 |
| ·lat基因互补缺失重组质粒pKCLHS、pKCLES的构建 | 第49-51页 |
| ·重组质粒pKCLHS、pKCLES的体外构建 | 第49-50页 |
| ·重组质粒pKCLHS、pKCLES转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定 | 第50-51页 |
| ·质粒转化棒状链霉菌原生质体的研究 | 第51-58页 |
| ·棒状链霉菌菌丝体培养条件的优化 | 第51-53页 |
| ·蔗糖浓度的确定 | 第51页 |
| ·碳源的确定 | 第51-52页 |
| ·pH值的确定 | 第52页 |
| ·甘氨酸浓度的确定 | 第52-53页 |
| ·棒状链霉菌原生质体制备条件的优化 | 第53-54页 |
| ·棒状链霉菌生长曲线的绘制 | 第53页 |
| ·溶菌酶用量及酶解时间的确定 | 第53-54页 |
| ·棒状链霉菌原生质体再生条件的优化 | 第54-56页 |
| ·再生培养基的确定 | 第54-55页 |
| ·再生培养基干燥程度的影响 | 第55页 |
| ·涂布方法的选择 | 第55页 |
| ·再生率的确定 | 第55-56页 |
| ·棒状链霉菌原生质体转化条件的研究 | 第56-57页 |
| ·原生质体和质粒DNA的浓度 | 第56页 |
| ·阿泊拉霉素的选择时间 | 第56页 |
| ·抗生素的选择浓度 | 第56页 |
| ·对原生质体进行热处理 | 第56-57页 |
| ·聚乙二醇的类型及浓度的选择 | 第57页 |
| ·棒状链霉菌lat基因阻断菌株的获得 | 第57-58页 |
| 4 结论 | 第58-60页 |
| 5 展望 | 第60-61页 |
| 6 致谢 | 第61-62页 |
| 7 参考文献 | 第62-67页 |
| 8 附录 | 第67-69页 |
| 9 论文发表情况 | 第69页 |
