| 1 前言 | 第1-26页 |
| ·TuMV概述 | 第10-11页 |
| ·TuMV生物学 | 第10-11页 |
| ·TuMV分子结构 | 第11页 |
| ·植物RNA病毒侵染性全长cDNA克隆 | 第11-16页 |
| ·侵染性克隆载体的构建 | 第12-13页 |
| ·cDNA合成 | 第12页 |
| ·质粒载体的构建 | 第12-13页 |
| ·侵染性克隆质粒在大肠杆菌中扩增的稳定性 | 第13页 |
| ·影响侵染性克隆对寄主植物侵染活性的因素 | 第13-15页 |
| ·5’端帽子结构对侵染活性的影响 | 第13-14页 |
| ·3’端poly(A)尾巴对侵染活性的影响 | 第14页 |
| ·非病毒核苷酸对侵染活性的影响 | 第14-15页 |
| ·5’端非病毒核苷酸 | 第14-15页 |
| ·3’端非病毒核苷酸 | 第15页 |
| ·内含子对侵染活性的影响 | 第15页 |
| ·接种方法对侵染活性的影响 | 第15页 |
| ·侵染性克隆cDNA体内转录表达的优点 | 第15-16页 |
| ·植物病毒侵染性克隆的应用 | 第16页 |
| ·侵染性cDNA克隆注意事项 | 第16页 |
| ·植物病毒表达载体的研究 | 第16-24页 |
| ·病毒表达载体发展史 | 第16-17页 |
| ·植物病毒表达载体的优点 | 第17-18页 |
| ·植物病毒表达载体构建策略 | 第18-23页 |
| ·基因置换 | 第18-19页 |
| ·基因插入 | 第19-21页 |
| ·抗原呈现 | 第21-22页 |
| ·基因互补 | 第22-23页 |
| ·植物病毒表达载体的应用 | 第23-24页 |
| ·研究基因重组 | 第23页 |
| ·研究基因沉默 | 第23页 |
| ·研究基因功能 | 第23页 |
| ·研究病毒运动 | 第23页 |
| ·商业上的利用 | 第23-24页 |
| ·植物病毒表达载体存在的问题 | 第24页 |
| ·降钙素基因相关肽研究 | 第24-25页 |
| ·CGRP的分子结构 | 第24-25页 |
| ·CGRP的分布 | 第25页 |
| ·CGRP的生物学功能 | 第25页 |
| ·本项目研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 材料和方法 | 第26-42页 |
| ·试验材料 | 第26-27页 |
| ·供试载体 | 第26页 |
| ·毒源 | 第26页 |
| ·TuMV单克隆抗体 | 第26页 |
| ·供试健康寄主 | 第26页 |
| ·质粒载体及受体菌 | 第26页 |
| ·供试PCR酶类及相关试剂 | 第26页 |
| ·供试限制性内切酶及修饰酶 | 第26页 |
| ·供试分子量标准 | 第26-27页 |
| ·DNA回收/纯化试剂盒 | 第27页 |
| ·供试生化及分子生物学试剂 | 第27页 |
| ·主要仪器 | 第27页 |
| ·PCR引物 | 第27页 |
| ·试验方法 | 第27-42页 |
| ·将pVIR95T侵染性克隆改造成具有多克隆位点的表达载体 | 第27-35页 |
| ·引物设计 | 第27-29页 |
| ·TuMV NIa蛋白酶酶切识别序列分析 | 第27-28页 |
| ·Adaptor中NIa蛋白酶切位点设计 | 第28页 |
| ·PCR引物设计 | 第28-29页 |
| ·第一中间载体的构建 | 第29-32页 |
| ·目的片段的获得 | 第29-31页 |
| ·T4 DNA连接酶连接 | 第31页 |
| ·转化大肠杆菌感受态细胞 | 第31页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第31-32页 |
| ·菌种保存 | 第32页 |
| ·第二中间载体的构建 | 第32-33页 |
| ·PCR引入Adaptor | 第32页 |
| ·PCR产物电泳及回收 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的自连 | 第33页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第33页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第33页 |
| ·pVIR95TM表达载体的克隆 | 第33页 |
| ·目的片段的获得 | 第33页 |
| ·T4 DNA连接酶切连接 | 第33页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第33页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第33页 |
| ·pVIR95TM侵染活性鉴定 | 第33-35页 |
| ·pVIR95TM质粒DNA的提取 | 第33-34页 |
| ·机械摩擦接种寄主植物TGM | 第34页 |
| ·观察症状发生发展 | 第34页 |
| ·一步法RT-PCR检测病毒粒子 | 第34-35页 |
| ·利用pVIR95TM构建人降血钙素基因相关肽(hCGRP)表达载体 | 第35-37页 |
| ·DNA序列合成 | 第35页 |
| ·hCGRP基因的PCR扩增 | 第35页 |
| ·PCR产物的酶切和回收 | 第35-36页 |
| ·pVIR95TM的酶切和回收 | 第36页 |
| ·酶切后的hCGRP基因与pVIR95TM载体的连接 | 第36-37页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第37页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第37页 |
| ·重组质粒DNA序列分析 | 第37页 |
| ·TuMV CHN5株系cDNA克隆 | 第37-42页 |
| ·TuMV CHN5株系免疫捕获RT-PCR | 第37-38页 |
| ·引物设计 | 第37页 |
| ·免疫捕获RT-PCR | 第37-38页 |
| ·PCR产物的T-A克隆 | 第38页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第38页 |
| ·cDNA序列分析 | 第38页 |
| ·利用pVIR95TM将TuMV CHN5株系构建成表达载体 | 第38-42页 |
| ·PCR引物设计 | 第38-39页 |
| ·PCR扩增 | 第39页 |
| ·PCR产物及pVIR95TM质粒的双酶切 | 第39-40页 |
| ·酶切后目的片段的回收 | 第40页 |
| ·目的片段的连接 | 第40页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态菌 | 第40页 |
| ·阳性克隆的分析 | 第40-42页 |
| ·PCR分析 | 第40-41页 |
| ·酶切带型分析 | 第41页 |
| ·重组质粒DNA序列分析 | 第41-42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-50页 |
| ·pVIR95T双酶切 | 第42页 |
| ·第一中间载体pBV95MS克隆的PCR筛选 | 第42页 |
| ·PCR介导pBV95MS中Adaptor的引入 | 第42-43页 |
| ·第二中间载体pBV95MSI双酶切 | 第43页 |
| ·pVIR95T单克隆PCR筛选 | 第43-44页 |
| ·pVIR95TM侵染活性鉴定 | 第44页 |
| ·一步法RT-PCR病毒粒子检测 | 第44-45页 |
| ·人降血钙素基因相关肽(hCGRP)基因PCR扩增 | 第45页 |
| ·pVIR95TCa单克隆PCR筛选 | 第45页 |
| ·pVIR95TCa克隆中hCGRP编码序列分析 | 第45页 |
| ·TuMV CHN5株系免疫捕获RT-PCR扩增结果 | 第45页 |
| ·CHN5 cDNA阳性克隆PCR鉴定 | 第45-46页 |
| ·TuMV CHN5株系CP基因序列分析 | 第46-47页 |
| ·TuMV CHN5 PCR扩增 | 第47页 |
| ·pVIR95TM质粒的双酶切 | 第47-48页 |
| ·重组质粒pVIRCHN5 PCR分析 | 第48页 |
| ·pVIRCHN5酶切分析 | 第48页 |
| ·pVIRCHN5 DNA序列分析 | 第48-50页 |
| 4 结论与讨论 | 第50-53页 |
| ·创新点 | 第50页 |
| ·讨论 | 第50-53页 |
| ·病毒核酸的获得 | 第50页 |
| ·长片段的RT-PCR | 第50页 |
| ·病毒载体活性鉴定 | 第50-51页 |
| ·TuMV CHN5株系cDNA克隆的可能利用价值 | 第51-52页 |
| ·研究病毒重组 | 第51页 |
| ·研究病毒运动 | 第51-52页 |
| ·研究病毒基因功能 | 第52页 |
| ·TuMV作为表达载体的缺陷 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-61页 |
| 附录A: 碱裂解法质粒DNA小量提取 | 第61-63页 |
| 附录B: 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第63-65页 |
| 附录C: pVIR95TCa载体以CP-F引物测序结果 | 第65-66页 |
| 附录D: TuMV CHN5株系CP基因测序结果 | 第66-68页 |
| 附录E: pVIRCHN5载体中以NIa-F引物测序结果 | 第68-69页 |
| 缩写词 | 第69-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 个人简历 | 第72页 |
