| 1 前言 | 第1-30页 |
| 1．1 聚羟基脂肪酸酯（PHA）的简介和研究历史 | 第14-15页 |
| 1．2 PHA的物化性质和降解研究 | 第15-19页 |
| 1．2．1 PHA的物化性质 | 第15-17页 |
| 1．2．2 PHA与聚合物共混研究 | 第17页 |
| 1．2．3 PHA的降解研究 | 第17-19页 |
| 1．3 PHA的生物学功能 | 第19页 |
| 1．4 PHA的应用 | 第19-21页 |
| 1．4．1 生物可降解塑料 | 第19-20页 |
| 1．4．2 PHA在组织工程中的应用 | 第20-21页 |
| 1．4．3 HA—良好的手性化合物 | 第21页 |
| 1．4．4 PHA在其它领域的应用前景 | 第21页 |
| 1．5 PHA的分子生物学研究 | 第21-24页 |
| 1．5．1 与PHA代谢相关的酶 | 第21-22页 |
| 1．5．2 PHA的生物合成途径 | 第22-24页 |
| 1．6 PHA合成酶的分类和基因排列规律 | 第24-25页 |
| 1．7 PHA合成酶的克隆方案 | 第25-27页 |
| 1．8 PHA研究的展望 | 第27-28页 |
| 1．9 基因敲除的方法 | 第28-29页 |
| 1．10 论文的目的和意义 | 第29-30页 |
| 2 实验材料与基本实验方法 | 第30-44页 |
| 2．1 材料 | 第30-34页 |
| 2．1．1 菌种和质粒 | 第30-31页 |
| 2．1．2 常用酶和生化试剂 | 第31-32页 |
| 2．1．2．1 分子生物学常用酶 | 第31页 |
| 2．1．2．2 分子生物学常用生化试剂 | 第31-32页 |
| 2．1．3 试剂盒、缓冲液和DNA标准物 | 第32-33页 |
| 2．1．3．1 试剂盒 | 第32页 |
| 2．1．3．2 常用溶液和缓冲液 | 第32-33页 |
| 2．1．3．3 DNA标准物 | 第33页 |
| 2．1．4 仪器和设备 | 第33-34页 |
| 2．2 常用实验操作方法 | 第34-44页 |
| 2．2．1 培养基的配制及菌种保存 | 第34页 |
| 2．2．1．1 培养基的配制 | 第34页 |
| 2．2．1．2 常用抗生素的配制 | 第34页 |
| 2．2．1．3 细菌的培养与保存 | 第34页 |
| 2．2．2 基因组DNA的制备 | 第34-35页 |
| 2．2．2．1 假单胞菌基因组DNA的大量制备 | 第34-35页 |
| 2．2．2．2 假单胞菌基因组DNA的小量制备 | 第35页 |
| 2．2．3 质粒的快速提取 | 第35-37页 |
| 2．2．3．1 鼎国质粒快速提取试剂盒 | 第35-36页 |
| 2．2．3．2 新芝质粒快速提取试剂盒 | 第36-37页 |
| 2．2．4 DNA片段的回收 | 第37-38页 |
| 2．2．4．1 鼎国DNA快速纯化／回收试剂盒 | 第37-38页 |
| 2．2．4．2 GFX~（TM）PCR及凝胶回收纯化DNA试剂盒 | 第38页 |
| 2．2．5 琼脂糖凝胶电泳 | 第38-39页 |
| 2．2．6 质粒的酶切及载体与目的片段的连接 | 第39页 |
| 2．2．6．1 酶切反应 | 第39页 |
| 2．2．6．2 载体与目的片段的连接 | 第39页 |
| 2．2．7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第39-40页 |
| 2．2．7．1 电转化感受态细胞的制备 | 第39-40页 |
| 2．2．7．2 电转化法 | 第40页 |
| 2．2．8 目的片段的PCR扩增 | 第40页 |
| 2．2．9 菌落直接PCR鉴定 | 第40-41页 |
| 2．2．10 重组质粒菌落的鉴定 | 第41页 |
| 2．2．10．1 试剂配置 | 第41页 |
| 2．2．10．2 重组菌落的蓝白斑筛选 | 第41页 |
| 2．2．10．3 重组质粒的酶切鉴定 | 第41页 |
| 2．2．11 DNA末端的去磷酸化 | 第41-42页 |
| 2．2．12 DNA序列分析 | 第42页 |
| 2．2．13 摇瓶培养条件 | 第42-44页 |
| 2．2．13．1 微量元素培养基（MM）的配置 | 第42-43页 |
| 2．2．13．2 种子培养 | 第43页 |
| 2．2．13．3 摇瓶培养条件 | 第43-44页 |
| 2．2．14 应用气相色谱（GC）对PHA进行检测 | 第44页 |
| 2．2．14．1 样品准备 | 第44页 |
| 2．2．14．2 标样的制备 | 第44页 |
| 2．2．14．3 GC分析 | 第44页 |
| 2．2．15 分子设计辅助软件和网上数据资源 | 第44页 |
| 3 快速克隆Ⅱ型PHA合成酶基因方法的建立 | 第44-55页 |
| 3．1 实验步骤 | 第44-47页 |
| 3．1．1 PCR反应的引物和模板 | 第45页 |
| 3．1．2 降落PCR（Touch-down PCR）的条件 | 第45-46页 |
| 3．1．3 目的基因与载体的连接与转化 | 第46-47页 |
| 3．1．3．1 PCR扩增的目的片段的回收 | 第46页 |
| 3．1．3．2 连接反应 | 第46-47页 |
| 3．1．3．3 重组质粒的电转化 | 第47页 |
| 3．1．4 重组体的筛选与鉴定 | 第47页 |
| 3．2 实验结果与分析 | 第47-51页 |
| 3．2．1 PCR模板的获得 | 第47页 |
| 3．2．2 PCR反应的结果及目的片段的回收 | 第47-49页 |
| 3．2．3 重组体的筛选 | 第49-51页 |
| 3．2．3．1 单酶切验证 | 第49-50页 |
| 3．2．3．2 双酶切验证 | 第50-51页 |
| 3．3 讨论 | 第51-55页 |
| 3．3．1 克隆方案的设计 | 第51-53页 |
| 3．3．2 用于克隆研究的菌株的选择 | 第53-54页 |
| 3．3．3 降落PCR条件的优化 | 第54-55页 |
| 3．3．4 对克隆方案的评价 | 第55页 |
| 4 克隆基因序列的同源性分析 | 第55-72页 |
| 4．1 实验步骤 | 第55-56页 |
| 4．1．1 序列的测定 | 第55页 |
| 4．1．2 目的基因的确定及同源性分析 | 第55-56页 |
| 4．2 实验结果与分析 | 第56-70页 |
| 4．2．1 序列测定结果 | 第56-63页 |
| 4．2．1．1 P．nitroreducens 0802Y phaC1和phaC2片段 | 第56-58页 |
| 4．2．1．2 P．pseudoalcaligenes HBQ06 phaC1片段 | 第58-59页 |
| 4．2．1．3 P．pseudoalcaligenes YS1 phaC1和phaC2片段 | 第59-61页 |
| 4．2．1．4 B．caryophylli YS13 phaC1和phaC2片段 | 第61-63页 |
| 4．2．2 目的基因的确定 | 第63-65页 |
| 4．2．2．1 P．nitroreducens 0802Y的phaC1、phaZ和phaC2基因 | 第63-64页 |
| 4．2．2．2 P．pseudoalcaligenes HBQ06的phaC1基因 | 第64页 |
| 4．2．2．3 P．pseudoalcaligenes YS1的phaC1、phaZ和phaC2基因 | 第64页 |
| 4．2．2．4 B．caryophylli YS13的phaC1、phaZ和phaC2基因 | 第64-65页 |
| 4．2．3 基因及蛋白的同源性分析 | 第65-70页 |
| 4．2．3．1 基因的同源性分析 | 第65-66页 |
| 4．2．3．2 蛋白质的同源性分析 | 第66-68页 |
| 4．2．3．3 由蛋白质的同源性分析得出各基因间的进化关系 | 第68-70页 |
| 4．3 讨论 | 第70-72页 |
| 4．3．1 PhaC1和PhaC2蛋白之间的进化关系 | 第70-71页 |
| 4．3．2 对PHA合成酶进化途径的推测 | 第71-72页 |
| 5 表达载体的构建及其在野生型大肠杆菌中的表达 | 第72-86页 |
| 5．1 实验步骤 | 第72-77页 |
| 5．1．1 含目的基因的表达载体的构建 | 第72-77页 |
| 5．1．2 表达载体在野生型大肠杆菌中的表达 | 第77页 |
| 5．2 实验结果与分析 | 第77-85页 |
| 5．2．1 表达载体的酶切验证 | 第77-81页 |
| 5．2．2 摇瓶实验结果 | 第81-85页 |
| 5．2．2．1 含有pBHR69-0802Y-C2的大肠杆菌的摇瓶实验 | 第81-83页 |
| 5．2．2．2 含有pBHR69-HBQ06-C1的大肠杆菌的摇瓶实验结果 | 第83-85页 |
| 5．2．2．3 含有pBHR69-YS1-C1／C2以及pBHR69-YS13-C1／C2的大肠杆菌摇瓶实验结果 | 第85页 |
| 5．3 讨论 | 第85-86页 |
| 5．3．1 葡萄糖浓度和加入时间以及IPTG诱导时间对PHA合成的影响 | 第85页 |
| 5．3．2 不同PHA合成酶在野生型大肠杆菌中的合成能力 | 第85-86页 |
| 6 大肠杆菌脂肪酸降解fadB缺失突变株的构建 | 第86-92页 |
| 6．1 实验设计 | 第86-88页 |
| 6．1．1 菌种和质粒 | 第86页 |
| 6．1．2 实验原理及引物设计 | 第86-88页 |
| 6．1．2．1 实验原理 | 第86页 |
| 6．1．2．2 引物的设计 | 第86-87页 |
| 6．1．2．3 用于同源重组的PCR片段的获得 | 第87-88页 |
| 6．1．3 大肠杆菌KM32感受态的制备及高频电转化 | 第88页 |
| 6．1．4 转化体的验证 | 第88页 |
| 6．1．5 含PHA合成酶基因的质粒在缺失突变株中的表达 | 第88页 |
| 6．1．5．1 含PHA合成酶基因质粒的转化和鉴定 | 第88页 |
| 6．1．5．2 缺失突变株中PHA的分离和检测 | 第88页 |
| 6．2 实验结果与分析 | 第88-91页 |
| 6．2．1 用于同源重组的线形片段的获得 | 第88-89页 |
| 6．2．2 转化体的验证 | 第89-90页 |
| 6．2．3 含PHA合成酶基因质粒的转化和鉴定 | 第90页 |
| 6．2．4 表达的PHA的分离和检测 | 第90-91页 |
| 6．3 讨论 | 第91-92页 |
| 7 Burkholderia caryophylli YS13 PHA合成途径的研究 | 第92-95页 |
| 7．1 实验步骤 | 第92-93页 |
| 7．1．1 B．caryophylli YS13的摇瓶实验 | 第92页 |
| 7．1．2 pKKH-YS13-C1及pKKH-YS13-C2在KM32B中的表达 | 第92-93页 |
| 7．2 实验结果与分析 | 第93-94页 |
| 7．2．1 B．caryophylli YS13的摇瓶实验结果 | 第93页 |
| 7．2．2 重组菌的摇瓶实验结果 | 第93-94页 |
| 7．3 讨论 | 第94-95页 |
| 8 结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-105页 |
| 致谢 | 第105-106页 |
| 附录 | 第106-137页 |
| 附录1 论文缩略表 | 第106-107页 |
| 附录2 主要质粒图谱 | 第107-111页 |
| 附录3 克隆的PHA合成酶的DNA序列 | 第111-123页 |
| 1． P．nitroreducens 0802Y pha locus的基因全序列 | 第111-114页 |
| 2． P．pseudoalcaligenes HBQ06 phaC1基因的全序列 | 第114-116页 |
| 3． P．pseudoalcaligenes YS1 pha locus的基因全序列 | 第116-120页 |
| 4． B．caryophylli YS13 pha locus的基因全序列 | 第120-123页 |
| 附录4 克隆的PHA合成酶的氨基酸序列 | 第123-126页 |
| 1． P．nitroreducens 0802Y phaC1的氨基酸序列 | 第123页 |
| 2． P．nitroreducens 0802Y phaZ的氨基酸序列 | 第123-124页 |
| 3． P．nitroreducens 0802Y phaC2的氨基酸序列 | 第124页 |
| 4． P．pseudoalcaligenes HBQ06 phaC1的氨基酸序列 | 第124页 |
| 5． P．pseudoalcaligenes YS1 phaC1的氨基酸序列 | 第124-125页 |
| 6． P．pseudoalcaligenes YS1 phaZ的氨基酸序列 | 第125页 |
| 7． P．pseudoalcaligenes YS1 phaC2氨基酸序列 | 第125页 |
| 8． B．caryophylli YS13 phaC1的氨基酸序列 | 第125-126页 |
| 9． B．caryophylli YS13 phaZ的氨基酸序列 | 第126页 |
| 10． B．caryophylli YS13 phaC2的氨基酸序列 | 第126页 |
| 附录5 克隆的PHA合成酶的氨基酸序列比较 | 第126-137页 |
| 1． phaC1编码氨基酸序列比较 | 第127-131页 |
| 2． phaZ编码氨基酸序列比较 | 第131-133页 |
| 3． phaC2编码氨基酸序列比较 | 第133-137页 |
| 个人简历、在学期间发表的主要学术论文 | 第137页 |
