| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-13页 |
| 英文缩写 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-18页 |
| ·Bok蛋白简介 | 第14-15页 |
| ·Flag融合蛋白标签简介 | 第15页 |
| ·颗粒酶B简介 | 第15-16页 |
| ·Caspase3及其融合蛋白简介 | 第16-18页 |
| 第二章 pCTEL-FLAG-Bok融合蛋白表达质粒的构建,表达及功能研究 | 第18-36页 |
| ·引言 | 第18页 |
| ·材料与方法 | 第18-29页 |
| ·材料 | 第18-21页 |
| ·质粒载体 | 第18页 |
| ·主要试剂和工具酶 | 第18-19页 |
| ·菌种 | 第19页 |
| ·细胞株 | 第19-20页 |
| ·主要仪器 | 第20页 |
| ·溶液配制 | 第20-21页 |
| ·方法 | 第21-29页 |
| ·提取细胞总RNA | 第21页 |
| ·cDNA的制备 | 第21-22页 |
| ·Bok(BCL2-related ovarian killer)全长基因片段的克隆 | 第22-23页 |
| ·PCR产物的鉴定,纯化和回收 | 第23页 |
| ·DNA片段和质粒的酶切和连接 | 第23-24页 |
| ·大肠杆菌JM109感受态细胞的制备及转化 | 第24页 |
| ·转化子的质粒小量提取及鉴定 | 第24-25页 |
| ·质粒大量提取 | 第25-26页 |
| ·MCF7人乳腺癌细胞和HeLa人宫颈癌细胞的培养 | 第26页 |
| ·MCF7人乳腺癌细胞和HeLa人宫颈癌细胞的转染 | 第26-27页 |
| ·Western blot方法检测FLAG-Bok融合蛋白的表达 | 第27-28页 |
| ·显微镜观察转染后的细胞形态 | 第28页 |
| ·转染后的HeLa细胞Hochest33258染色观察 | 第28页 |
| ·细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测转染后的MCF7细胞状态 | 第28-29页 |
| ·Western Blot方法检测凋亡标志性蛋白PARP在MCF7细胞中的表达 | 第29页 |
| ·结果 | 第29-34页 |
| ·基因克隆及质粒构建结果 | 第29-30页 |
| ·测序结果 | 第30页 |
| ·FLAG-Bok在MCF7细胞和HeLa细胞中的表达情况 | 第30页 |
| ·转染后的MCF7,HeLa,COS7细胞形态的变化 | 第30-31页 |
| ·Hoechst 33258单染后观察FLAG-Bok融合蛋白对细胞形态的影响 | 第31-32页 |
| ·细胞凋亡与坏死检测染色试剂盒检测融合蛋白表达后的细胞状态。 | 第32-33页 |
| ·Western Blot方法检测凋亡下游蛋白PARP的表达情况 | 第33-34页 |
| ·讨论 | 第34-36页 |
| 第三章 GZMB-CASP3融合蛋白质粒的构建表达与功能研究 | 第36-54页 |
| ·引言 | 第36页 |
| ·材料 | 第36-39页 |
| ·质粒载体 | 第36页 |
| ·主要试剂和工具酶 | 第36-37页 |
| ·菌种 | 第37页 |
| ·细胞株 | 第37页 |
| ·主要仪器 | 第37-38页 |
| ·溶液配制 | 第38-39页 |
| ·方法 | 第39-47页 |
| ·提取细胞总RNA及cDNA的制备 | 第39-40页 |
| ·GranzymeB活性区域基因片段的克隆 | 第40-41页 |
| ·Caspase3全长基因片段的克隆 | 第41-42页 |
| ·PCR产物的鉴定和纯化 | 第42-43页 |
| ·DNA片段和质粒的酶切纯化和连接 | 第43-44页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化 | 第44页 |
| ·转化子的质粒小量提取及鉴定 | 第44-45页 |
| ·质粒大量提取 | 第45-46页 |
| ·MCF7人乳腺癌细胞的培养和转染 | 第46页 |
| ·Western blot方法检测GZMB-CASP3融合蛋白的表达 | 第46页 |
| ·显微镜观察转染后的细胞形态 | 第46页 |
| ·细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测转染后的MCF7细胞状态 | 第46-47页 |
| ·结果 | 第47-52页 |
| ·目标基因的克隆 | 第47-48页 |
| ·质粒的构建 | 第48-49页 |
| ·测序结果与预期比对 | 第49-50页 |
| ·MCF7细胞表达的GZMB-CASP3融合蛋白 | 第50页 |
| ·转染表达融合蛋白后的MCF7细胞在显微镜下观察细胞形态的变化 | 第50-51页 |
| ·细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测转染后的MCF7细胞状态 | 第51-52页 |
| ·应用Western Blot方法检测PARP蛋白表达 | 第52页 |
| ·讨论 | 第52-54页 |
| 第四章 融合蛋白GZMB-CASP3和FLAG-BOK的抑癌效果比较 | 第54-59页 |
| ·引言 | 第54页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·主要试剂 | 第54页 |
| ·细胞株 | 第54页 |
| ·主要仪器 | 第54-55页 |
| ·试剂配置 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-57页 |
| ·MCF7人乳腺癌细胞的培养和转染 | 第56页 |
| ·MTT法检测融合蛋白GZMB-CASP3和FLAG-Bok对细胞增殖速率的影响 | 第56页 |
| ·半定量Western Blot检测凋亡下游蛋白PARP | 第56-57页 |
| ·结果 | 第57-58页 |
| ·MTT法检测融合蛋白GZMB-CASP3和FLAG-Bok对细胞增殖速率的影响 | 第57页 |
| ·半定量Western Blot检测凋亡下游蛋白PARP表达结果 | 第57-58页 |
| ·讨论 | 第58-59页 |
| 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
