| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| Part Ⅰ MTMR14稳定敲减细胞株的建立及表型分析 | 第13-62页 |
| 第一章 绪论 | 第13-26页 |
| 1.1 早期基因编辑技术 | 第13-16页 |
| 1.1.1 RNAi技术 | 第13-15页 |
| 1.1.2 ZFN技术 | 第15-16页 |
| 1.1.3 TALEN技术 | 第16页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9技术 | 第16-21页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统起源 | 第17页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas分类 | 第17页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9作用机理 | 第17-18页 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9的应用 | 第18-21页 |
| 1.2.4.1 医学领域 | 第19页 |
| 1.2.4.2 动物科学领域 | 第19-20页 |
| 1.2.4.3 植物科学领域 | 第20页 |
| 1.2.4.4 微生物学领域 | 第20-21页 |
| 1.3 MTMR14研究进展 | 第21-24页 |
| 1.3.1 概述 | 第21页 |
| 1.3.2 MTMR14的发现 | 第21页 |
| 1.3.3 MTMR14的基因和蛋白 | 第21-22页 |
| 1.3.4 MTMR14的生物学功能 | 第22-24页 |
| 1.3.4.1 MTMR14与CNM | 第22页 |
| 1.3.4.2 MTMR14与钙离子调节 | 第22-23页 |
| 1.3.4.3 MTMR14与自噬 | 第23-24页 |
| 1.4 本文构思 | 第24-26页 |
| 1.4.1 选题缘由 | 第24-25页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第25页 |
| 1.4.3 研究目的及意义 | 第25-26页 |
| 第二章 实验材料、仪器和试剂 | 第26-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第26页 |
| 2.2 实验仪器和耗材 | 第26-27页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第26页 |
| 2.2.2 实验耗材 | 第26-27页 |
| 2.3 实验试剂 | 第27-28页 |
| 2.4 溶液配制 | 第28-31页 |
| 2.4.1 构载体所需溶液 | 第28-29页 |
| 2.4.2 细胞培养所需溶液 | 第29页 |
| 2.4.3 WesternBlotting所需溶液 | 第29-30页 |
| 2.4.4 MTT所需溶液 | 第30页 |
| 2.4.5 流式细胞术所需溶液 | 第30-31页 |
| 第三章 实验方法 | 第31-46页 |
| 3.1 构建基因敲减细胞系 | 第31-41页 |
| 3.1.1 hMTMR14sgRNA序列的设计 | 第31页 |
| 3.1.2 PX458-sgRNA表达载体的构建和鉴定 | 第31-35页 |
| 3.1.3 细胞培养 | 第35-36页 |
| 3.1.3.1 细胞复苏 | 第35页 |
| 3.1.3.2 细胞换液与传代 | 第35-36页 |
| 3.1.3.3 细胞冻存 | 第36页 |
| 3.1.4 细胞转染 | 第36-37页 |
| 3.1.4.1 提质粒 | 第36-37页 |
| 3.1.4.2 Lipo-2000转染 | 第37页 |
| 3.1.4.3 Lipo-3000转染 | 第37页 |
| 3.1.5 流式细胞仪分选 | 第37页 |
| 3.1.6 单细胞培养 | 第37-38页 |
| 3.1.7 测序鉴定 | 第38-39页 |
| 3.1.7.1 提取细胞基因组 | 第38页 |
| 3.1.7.2 PCR扩增细胞基因组和测序 | 第38-39页 |
| 3.1.8 错配酶酶切鉴定 | 第39-40页 |
| 3.1.9 Western Blotting检测MTMR14的表达 | 第40-41页 |
| 3.1.9.1 细胞总蛋白的提取 | 第40页 |
| 3.1.9.2 Western Blotting | 第40-41页 |
| 3.2 MTT检测细胞生长速率 | 第41-42页 |
| 3.2.1 细胞计数 | 第41页 |
| 3.2.2 测定标准曲线 | 第41-42页 |
| 3.2.3 测定细胞生长速率 | 第42页 |
| 3.3 流式细胞术检测细胞周期 | 第42-43页 |
| 3.3.1 细胞收集与固定 | 第42页 |
| 3.3.2 细胞染色及检测 | 第42-43页 |
| 3.4 Real-time PCR检测细胞周期调控因子转录水平 | 第43-45页 |
| 3.4.1 总RNA的提取 | 第43页 |
| 3.4.2 逆转录PCR | 第43-45页 |
| 3.4.3 Real-time PCR | 第45页 |
| 3.5 统计分析 | 第45-46页 |
| 第四章 MTMR14基因敲减细胞系的建立 | 第46-56页 |
| 4.1 构建MTMR14基因敲减的293T细胞 | 第46-52页 |
| 4.1.1 引言 | 第46页 |
| 4.1.2 分析PX458载体序列 | 第46-48页 |
| 4.1.3 构建PX458-sgRNA表达载体 | 第48-50页 |
| 4.1.4 细胞转染以及流式细胞分选 | 第50页 |
| 4.1.5 PCR和测序分析流式分选细胞基因组序列 | 第50-52页 |
| 4.1.6 PX458-sgRNA表达载体的靶向敲除效果检测 | 第52页 |
| 4.2 构建基因敲减的A549细胞 | 第52-55页 |
| 4.2.1 引言 | 第52-53页 |
| 4.2.2 细胞转染 | 第53页 |
| 4.2.3 分选细胞的基因组测序分析 | 第53-54页 |
| 4.2.4 PX458-sgRNA表达载体的靶向敲除效果检测 | 第54-55页 |
| 4.3 小结 | 第55-56页 |
| 第五章 MTMR14基因敲减的A549细胞系表型分析 | 第56-60页 |
| 5.1 引言 | 第56页 |
| 5.2 实验结果与分析 | 第56-58页 |
| 5.2.1 MTT检测MTMR14表达的减少对细胞增殖的影响 | 第56-57页 |
| 5.2.2 流式细胞术检测细胞周期 | 第57-58页 |
| 5.2.3 Real-timePCR检测细胞周期调控因子转录水平 | 第58页 |
| 5.3 小结 | 第58-60页 |
| 第六章 讨论与展望 | 第60-62页 |
| Part Ⅱ 基于CRISPR/Cas9技术建立RhoA基因敲除小鼠 | 第62-78页 |
| 第一章 前言 | 第62-64页 |
| 1.1 CRISPR/Cas9建立基因敲除小鼠概述 | 第62页 |
| 1.2 RhoA概述 | 第62-63页 |
| 1.3 本文构想 | 第63-64页 |
| 第二章 实验材料、仪器和试剂 | 第64-65页 |
| 2.1 实验材料 | 第64页 |
| 2.2 实验仪器 | 第64页 |
| 2.3 实验试剂 | 第64-65页 |
| 第三章 实验方法 | 第65-72页 |
| 3.1 sgRNA和检测引物的设计 | 第65-66页 |
| 3.2 sgRNA体外活性检测 | 第66-70页 |
| 3.2.1 PCR扩增反应 | 第66-67页 |
| 3.2.2 检测和回收PCR产物 | 第67页 |
| 3.2.3 gRNA转录 | 第67-68页 |
| 3.2.4 回收和提取gRNA | 第68页 |
| 3.2.5 用于酶切的dsDNA扩增和切胶回收 | 第68-69页 |
| 3.2.6 spCas9/gRNA体外酶切反应 | 第69-70页 |
| 3.3 体外转录sgRNA/Cas9mRNA | 第70页 |
| 3.4 超排卵与小鼠受精卵的获取 | 第70页 |
| 3.5 小鼠受精卵显微注射sgRNA/Cas9mRNA | 第70-71页 |
| 3.6 胚胎移植 | 第71页 |
| 3.7 利用PCR和测序对F0代小鼠进行基因型鉴定 | 第71-72页 |
| 第四章 实验结果 | 第72-76页 |
| 4.1 体外sgRNA活性检测 | 第72-73页 |
| 4.2 体外转录sgRNA/Cas9mRNA | 第73页 |
| 4.3 显微注射 | 第73-74页 |
| 4.4 胚胎移植 | 第74页 |
| 4.5 基因型鉴定 | 第74-75页 |
| 4.6 小结 | 第75-76页 |
| 第五章 讨论与展望 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 | 第84页 |
