| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1. 前言 | 第12-31页 |
| 1.1 MAPK信号通路概述 | 第12-14页 |
| 1.1.1 ERK1/2信号通路 | 第13页 |
| 1.1.2 ERK5信号通路 | 第13-14页 |
| 1.1.3 JNK信号通路 | 第14页 |
| 1.2 p38信号通路 | 第14-21页 |
| 1.2.1 p38的分类 | 第14-16页 |
| 1.2.2 p38α结构特点 | 第16-17页 |
| 1.2.3 p38α的激活机制 | 第17-19页 |
| 1.2.4 p38α下游底物 | 第19页 |
| 1.2.5 p38α激活的生物学功能 | 第19-20页 |
| 1.2.6 p38α抑制剂研究进展 | 第20-21页 |
| 1.3 孤儿核受体Nur77概述 | 第21-28页 |
| 1.3.1 核受体超家族的分类 | 第21-22页 |
| 1.3.2 孤儿核受体Nur77的结构特点 | 第22-24页 |
| 1.3.3 Nur77相关的生理功能 | 第24-25页 |
| 1.3.4 p38α与Nur77研究进展 | 第25-28页 |
| 1.4 基于片段化的药物发现 | 第28-30页 |
| 1.5 本课题研究目的及意义 | 第30-31页 |
| 2. 实验材料与方法 | 第31-54页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-33页 |
| 2.1.1 质粒与菌株 | 第31页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第31-32页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第32-33页 |
| 2.2 实验试剂的配制 | 第33-38页 |
| 2.2.1 分子克隆相关试剂 | 第33-34页 |
| 2.2.2 培养基及细菌培养相关试剂 | 第34-35页 |
| 2.2.3 SDS-PAGE相关试剂 | 第35-38页 |
| 2.2.4 蛋白表达及纯化相关试剂 | 第38页 |
| 2.3 实验方法 | 第38-54页 |
| 2.3.1 重组蛋白表达质粒的构建 | 第38-45页 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第38-39页 |
| 2.3.1.2 引物设计 | 第39-40页 |
| 2.3.1.3 目的基因的PCR扩增与回收 | 第40-41页 |
| 2.3.1.4 表达质粒双酶切 | 第41-42页 |
| 2.3.1.5 LIC法构建重组表达质粒 | 第42页 |
| 2.3.1.6 重组质粒的转化 | 第42-43页 |
| 2.3.1.7 抽提质粒 | 第43页 |
| 2.3.1.8 定点突变 | 第43-44页 |
| 2.3.1.9 阳性克隆的鉴定 | 第44-45页 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达 | 第45-46页 |
| 2.3.2.1 重组蛋白的试表达 | 第45页 |
| 2.3.2.2 重组蛋白的大量诱导表达 | 第45-46页 |
| 2.3.3 重组蛋白的纯化 | 第46-48页 |
| 2.3.3.1 Ni柱亲和层析 | 第46-47页 |
| 2.3.3.2 重组蛋白浓缩与脱盐 | 第47页 |
| 2.3.3.3 离子交换层析 | 第47-48页 |
| 2.3.3.4 凝胶过滤层析 | 第48页 |
| 2.3.4 重组蛋白性质检测 | 第48-49页 |
| 2.3.5 重组蛋白的结晶 | 第49-52页 |
| 2.3.5.1 结晶条件的初步筛选 | 第49-50页 |
| 2.3.5.2 结晶条件的优化 | 第50页 |
| 2.3.5.3 蛋白晶体与小分子的soaking实验 | 第50页 |
| 2.3.5.4 蛋白晶体衍射数据的收集 | 第50-51页 |
| 2.3.5.5 蛋白晶体的结构解析 | 第51-52页 |
| 2.3.6 重组蛋白的相互作用分析 | 第52-54页 |
| 2.3.6.1 等温滴定量热法(ITC) | 第52-53页 |
| 2.3.6.2 NMR实验 | 第53-54页 |
| 3. 实验结果与分析 | 第54-81页 |
| 3.1 p38α蛋白的表达 | 第54-55页 |
| 3.2 p38α蛋白的纯化 | 第55-60页 |
| 3.2.1 Ni柱亲和层析纯化 | 第55-56页 |
| 3.2.2 脱盐 | 第56-57页 |
| 3.2.3 离子交换层析 | 第57-58页 |
| 3.2.4 凝胶过滤层析 | 第58-60页 |
| 3.3 p38α蛋白性质检测 | 第60页 |
| 3.4 p38α与Nur77-LBD多肽相互作用研究 | 第60-71页 |
| 3.4.1 Nur77-LBD多肽的合成与分析 | 第60-61页 |
| 3.4.2 p38α与Nur77-LBD多肽相互作用检测 | 第61-68页 |
| 3.4.2.1 ITC实验 | 第61-64页 |
| 3.4.2.2 NMR实验 | 第64-68页 |
| 3.4.3 p38α与Nur77-LBD多肽共结晶条件筛选 | 第68-69页 |
| 3.4.4 p38α与Nur77-LBD多肽复合物结晶条件优化 | 第69-70页 |
| 3.4.5 讨论与总结 | 第70-71页 |
| 3.5 p38α的药物筛选 | 第71-79页 |
| 3.5.1 p38α蛋白的结晶 | 第71-72页 |
| 3.5.2 p38α与片段小分子复合物的获得 | 第72页 |
| 3.5.3 衍射数据的收集及结构解析 | 第72-78页 |
| 3.5.4 讨论与总结 | 第78-79页 |
| 3.6 展望 | 第79-81页 |
| 参考文献 | 第81-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
