| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略表 | 第7-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-24页 |
| ·淀粉及其主要衍生物 | 第13-14页 |
| ·淀粉水解酶 | 第14-20页 |
| ·淀粉酶及其分类 | 第14-15页 |
| ·α-淀粉酶的结构及其催化机制 | 第15-19页 |
| ·α-淀粉酶的来源及应用 | 第19-20页 |
| ·真菌α-淀粉酶 | 第20-23页 |
| ·真菌α-淀粉酶的来源及性质 | 第20-21页 |
| ·真菌α-淀粉酶的种类 | 第21-22页 |
| ·真菌α-淀粉酶的应用 | 第22页 |
| ·真菌α-淀粉酶的异源表达 | 第22-23页 |
| ·本课题的立题依据及研究内容 | 第23-24页 |
| 第二章 米根霉α-淀粉酶基因的克隆与功能鉴定 | 第24-36页 |
| ·前言 | 第24页 |
| ·材料与方法 | 第24-27页 |
| ·菌株和质粒 | 第24页 |
| ·工具酶和试剂 | 第24页 |
| ·培养基和培养条件 | 第24-25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第25-26页 |
| ·米根霉RNA 的提取 | 第26页 |
| ·基因克隆、序列测定与分析 | 第26页 |
| ·质粒DNA 制备及DNA 的酶切、纯化、连接、大肠杆菌转化等分子操作 | 第26页 |
| ·RoAmy 在大肠杆菌中的表达及粗酶液的制备 | 第26-27页 |
| ·酶活测定 | 第27页 |
| ·SDS-PAGE | 第27页 |
| ·结果 | 第27-35页 |
| ·米根霉α-淀粉酶基因的扩增及序列测定 | 第27-29页 |
| ·重组大肠杆菌的构建 | 第29-30页 |
| ·RoAmy 的功能鉴定 | 第30-31页 |
| ·RoAmy 及其推衍氨基酸比对分析 | 第31-32页 |
| ·RoAmy 的结构分析 | 第32-34页 |
| ·RoAmy 的遗传进化分析 | 第34-35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| 第三章 重组米根霉α-淀粉酶的生化性质 | 第36-48页 |
| ·前言 | 第36页 |
| ·材料与方法 | 第36-38页 |
| ·菌株 | 第36页 |
| ·试剂 | 第36页 |
| ·培养基和培养条件 | 第36页 |
| ·主要仪器 | 第36页 |
| ·rRoAmy 的纯化 | 第36-37页 |
| ·rRoAmy 基本酶学性质 | 第37-38页 |
| ·寡糖的高压液相色谱分析 | 第38页 |
| ·酶活测定 | 第38页 |
| ·蛋白质浓度测定和SDS-PAGE | 第38页 |
| ·结果 | 第38-45页 |
| ·rRoAmy 的纯化 | 第38-39页 |
| ·温度和pH 对rRoAmy 的影响 | 第39-41页 |
| ·金属离子和EDTA 对rRoAmy 的影响 | 第41-42页 |
| ·rRoAmy 的米氏常数测定 | 第42页 |
| ·rRoAmy 对不同底物的水解效率 | 第42-43页 |
| ·rRoAmy 作用麦芽三糖终产物分析 | 第43页 |
| ·rRoAmy1 与商品真菌α-淀粉酶作用淀粉终产物比较 | 第43-45页 |
| ·讨论 | 第45-48页 |
| 第四章 米根霉α-淀粉酶在酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母中的表达 | 第48-59页 |
| ·前言 | 第48页 |
| ·材料与方法 | 第48-50页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·工具酶和试剂 | 第48页 |
| ·培养基和培养条件 | 第48-49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| ·酵母的转化 | 第49页 |
| ·重组酵母的筛选 | 第49页 |
| ·摇瓶发酵试验 | 第49-50页 |
| ·酶活测定 | 第50页 |
| ·SDS-PAGE | 第50页 |
| ·淀粉浓度的测定 | 第50页 |
| ·乙醇浓度的测定 | 第50页 |
| ·结果 | 第50-57页 |
| ·酿酒酵母表达质粒的构建及转化 | 第50页 |
| ·克鲁维乳酸酵母表达质粒的构建及转化 | 第50-51页 |
| ·具有α-淀粉酶分泌能力的重组酵母的检测与筛选 | 第51-52页 |
| ·RoAmy 在酿酒酵母中的分泌表达 | 第52页 |
| ·重组酿酒酵母利用淀粉的生长情况 | 第52-54页 |
| ·RoAmy 在克鲁维乳酸酵母中的分泌表达 | 第54-56页 |
| ·重组酵母克鲁维乳酸酵母利用淀粉的生长情况 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| 第五章 黑曲霉表达系统表达米根霉α-淀粉酶 | 第59-75页 |
| ·前言 | 第59页 |
| ·材料与方法 | 第59-62页 |
| ·菌株和质粒 | 第59-60页 |
| ·工具酶和试剂 | 第60页 |
| ·培养基和培养条件 | 第60页 |
| ·主要仪器 | 第60-61页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第61页 |
| ·黑曲霉电转化方法 | 第61-62页 |
| ·转化子的纯化 | 第62页 |
| ·基因拷贝数的测定 | 第62页 |
| ·RoAmy 在黑曲霉中的表达 | 第62页 |
| ·酶活测定 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-72页 |
| ·使用gpdA 启动子构建表达载体 | 第62-63页 |
| ·使用glaA 启动子构建表达载体 | 第63-66页 |
| ·电转化条件的建立 | 第66-69页 |
| ·重组菌株的遗传稳定性检测 | 第69页 |
| ·重组菌株的淀粉酶分泌能力检测 | 第69-70页 |
| ·RoAmy 基因拷贝数的测定 | 第70页 |
| ·淀粉酶利用不同启动子进行表达 | 第70-71页 |
| ·不同信号肽引导淀粉酶的分泌表达比较 | 第71页 |
| ·添加潮霉素B 对重组菌产淀粉酶的影响 | 第71-72页 |
| ·讨论 | 第72-75页 |
| 第六章 米根霉α-淀粉酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 | 第75-90页 |
| ·前言 | 第75页 |
| ·材料与方法 | 第75-78页 |
| ·菌株和质粒 | 第75-76页 |
| ·工具酶和试剂 | 第76页 |
| ·培养基和培养条件 | 第76页 |
| ·主要仪器 | 第76页 |
| ·寡核苷酸引物 | 第76页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第76页 |
| ·重组毕赤酵母的二次转化 | 第76-77页 |
| ·转化子的筛选 | 第77页 |
| ·基因拷贝数的测定 | 第77页 |
| ·RoAmy 在毕赤酵母中的分泌表达 | 第77-78页 |
| ·重组酵母胞内酶活的检测 | 第78页 |
| ·酶活测定 | 第78页 |
| ·SDS-PAGE 和Native-PAGE | 第78页 |
| ·结果 | 第78-88页 |
| ·诱导型表达质粒的构建 | 第78页 |
| ·组成型表达质粒的构建 | 第78-80页 |
| ·重组酵母的筛选与鉴定 | 第80-81页 |
| ·RoAmy 基因拷贝数的测定 | 第81页 |
| ·利用甲醇快速利用型重组酵母实现RoAmy 的过量表达 | 第81-82页 |
| ·组成型表达的研究 | 第82页 |
| ·利用混合型表达进一步提高RoAmy 的异源表达量 | 第82-83页 |
| ·利用自身信号肽实现RoAmy 在毕赤酵母中表达 | 第83-84页 |
| ·15 L 发酵罐放大试验 | 第84-88页 |
| ·讨论 | 第88-90页 |
| 主要结论 | 第90-92页 |
| 论文创新点 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-106页 |
| 附录：读博期间发表的论文 (含待发表) | 第106页 |
