| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-33页 |
| 1.1 我国苹果产业发展概况 | 第17页 |
| 1.2 我国苹果病毒病的种类及危害 | 第17-19页 |
| 1.3 苹果花叶病及其病原研究进展 | 第19-20页 |
| 1.3.1 分布及症状 | 第19页 |
| 1.3.2 苹果花叶病病原 | 第19-20页 |
| 1.4 等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)病毒分子生物学特性 | 第20-26页 |
| 1.4.1 病毒基因组结构 | 第20-22页 |
| 1.4.2 病毒分类地位 | 第22-23页 |
| 1.4.3 病毒粒子形态 | 第23-24页 |
| 1.4.4 寄主范围和病害症状 | 第24-25页 |
| 1.4.5 传播途径 | 第25-26页 |
| 1.5 植物病毒检测技术 | 第26-29页 |
| 1.5.1 生物学检测 | 第26页 |
| 1.5.2 血清学检测 | 第26-27页 |
| 1.5.3 电子显微镜检测 | 第27页 |
| 1.5.4 分子生物学检测 | 第27-29页 |
| 1.5.5 高通量测序技术检测植物病毒 | 第29页 |
| 1.6 植物病毒侵染性cDNA克隆及其应用 | 第29-32页 |
| 1.6.1 侵染性cDNA克隆 | 第29-30页 |
| 1.6.2 侵染性cDNA克隆的应用 | 第30-32页 |
| 1.7 本研究的内容与技术路线 | 第32页 |
| 1.8 本研究的目的与意义 | 第32-33页 |
| 第二章 ApNMV在我国苹果产区的发生分布调查 | 第33-49页 |
| 2.1 前言 | 第33页 |
| 2.2 材料 | 第33-35页 |
| 2.2.1 样品采集 | 第33-34页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第34页 |
| 2.2.3 载体与菌株 | 第34页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第34-35页 |
| 2.2.5 主要溶液配制 | 第35页 |
| 2.3 方法 | 第35-41页 |
| 2.3.1 植物总RNA提取 | 第35-36页 |
| 2.3.2 引物设计与合成 | 第36-37页 |
| 2.3.3 RT-PCR | 第37-40页 |
| 2.3.4 克隆测序 | 第40-41页 |
| 2.4 结果与分析 | 第41-47页 |
| 2.4.1 我国苹果花叶病症状 | 第41-42页 |
| 2.4.2 ApNMV在我国苹果产区发生分布调查 | 第42-43页 |
| 2.4.3 关于我国苹果花叶样品中ApMV检出分析 | 第43-45页 |
| 2.4.4 我国苹果花叶病与PNRSV关系分析 | 第45-47页 |
| 2.5 讨论 | 第47-49页 |
| 第三章 ApNMV全基因组扩增及分子进化研究 | 第49-65页 |
| 3.1 前言 | 第49页 |
| 3.2 材料 | 第49-51页 |
| 3.2.1 样品采集 | 第49-50页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第50页 |
| 3.2.3 载体与菌株 | 第50页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第50页 |
| 3.2.5 主要溶液配制 | 第50-51页 |
| 3.3 方法 | 第51-55页 |
| 3.3.1 植物总RNA提取 | 第51页 |
| 3.3.2 总RNA的3'端加poly-A结构 | 第51页 |
| 3.3.3 引物设计与合成 | 第51-52页 |
| 3.3.4 RT-PCR | 第52-54页 |
| 3.3.5 克隆测序 | 第54-55页 |
| 3.3.6 重组分析 | 第55页 |
| 3.3.7 系统发育与多样性分析 | 第55页 |
| 3.4 结果与分析 | 第55-62页 |
| 3.4.1 ApNMV中国分离物基因组序列分析 | 第55-58页 |
| 3.4.2 ApNMV分类地位鉴定 | 第58-60页 |
| 3.4.3 ApNMV MP和CP系统发育分析 | 第60页 |
| 3.4.4 ApNMV MP和CP多样性分析 | 第60-62页 |
| 3.4.5 与ApMV和PNRSV进化关系分析 | 第62页 |
| 3.5 讨论 | 第62-65页 |
| 第四章 ApNMV CP蛋白原核表达及ELISA检测体系建立 | 第65-75页 |
| 4.1 前言 | 第65页 |
| 4.2 材料 | 第65-67页 |
| 4.2.1 样品采集 | 第65页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第65页 |
| 4.2.3 载体与菌株 | 第65-66页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第66页 |
| 4.2.5 主要溶液配制 | 第66-67页 |
| 4.3 方法 | 第67-71页 |
| 4.3.1 植物总RNA提取 | 第67页 |
| 4.3.2 引物设计与合成 | 第67页 |
| 4.3.3 RT-PCR | 第67-68页 |
| 4.3.4 原核表达重组质粒构建 | 第68-69页 |
| 4.3.5 CP基因诱导表达及蛋白纯化 | 第69-70页 |
| 4.3.6 SDS-PAGE及Western-blot检测分析 | 第70页 |
| 4.3.7 多克隆抗血清制备及效价评定 | 第70页 |
| 4.3.8 酶联免疫吸附(ELISA)检测 | 第70-71页 |
| 4.4 结果与分析 | 第71-73页 |
| 4.4.1 CP基因克隆 | 第71页 |
| 4.4.2 原核表达重组质粒构建 | 第71页 |
| 4.4.3 CP基因诱导表达检测 | 第71-72页 |
| 4.4.4 重组蛋白大量表达及纯化 | 第72-73页 |
| 4.4.5 抗血清效价评定 | 第73页 |
| 4.4.6 样品检测 | 第73页 |
| 4.5 讨论 | 第73-75页 |
| 第五章 ApNMV RT-qPCR检测体系建立 | 第75-87页 |
| 5.1 前言 | 第75页 |
| 5.2 材料 | 第75-76页 |
| 5.2.1 样品采集 | 第75页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第75页 |
| 5.2.3 载体与菌株 | 第75页 |
| 5.2.4 主要仪器 | 第75-76页 |
| 5.2.5 主要溶液配制 | 第76页 |
| 5.3 方法 | 第76-80页 |
| 5.3.1 植物总RNA提取 | 第76页 |
| 5.3.2 引物设计与合成 | 第76-77页 |
| 5.3.3 RT-PCR | 第77页 |
| 5.3.4 pGEM-T:ApNMVCP重组质粒构建 | 第77-79页 |
| 5.3.5 体外转录 | 第79-80页 |
| 5.3.6 标准曲线制作 | 第80页 |
| 5.4 结果与分析 | 第80-86页 |
| 5.4.1 ApNMV CP序列扩增 | 第80-81页 |
| 5.4.2 pGEM-T:ApNMVCP重组质粒构建 | 第81-82页 |
| 5.4.3 体外转录 | 第82页 |
| 5.4.4 RT-qPCR引物与探针浓度优化 | 第82-83页 |
| 5.4.5 RT-qPCR标准曲线制作 | 第83-84页 |
| 5.4.6 RT-qPCR重复性分析 | 第84页 |
| 5.4.7 RT-qPCR特异性评估 | 第84-85页 |
| 5.4.8 RT-qPCR灵敏性分析 | 第85-86页 |
| 5.5 讨论 | 第86-87页 |
| 第六章 ApNMV全长侵染性cDNA克隆构建及致病性鉴定 | 第87-99页 |
| 6.1 前言 | 第87页 |
| 6.2 材料 | 第87-89页 |
| 6.2.1 样品采集 | 第87页 |
| 6.2.2 主要试剂 | 第87页 |
| 6.2.3 载体与菌株 | 第87-88页 |
| 6.2.4 主要仪器 | 第88页 |
| 6.2.5 主要溶液配制 | 第88-89页 |
| 6.3 方法 | 第89-93页 |
| 6.3.1 植物总RNA提取 | 第89页 |
| 6.3.2 引物设计与合成 | 第89-90页 |
| 6.3.3 RT-PCR | 第90-91页 |
| 6.3.4 重组质粒构建 | 第91-92页 |
| 6.3.5 农杆菌感受态细胞制备 | 第92-93页 |
| 6.3.6 农杆菌注射接种 | 第93页 |
| 6.3.7 摩擦接种 | 第93页 |
| 6.4 结果与分析 | 第93-97页 |
| 6.4.1 ApNMV RT-PCR全长扩增 | 第93-94页 |
| 6.4.2 ApNMV重组质粒构建 | 第94-95页 |
| 6.4.3 ApNMV全长cDNA克隆在本生烟上活性验证 | 第95页 |
| 6.4.4 ApNMV、ApMV全长cDNA侵染性克隆在黄瓜上的致病性验证 | 第95-97页 |
| 6.5 讨论 | 第97-99页 |
| 第七章 全文结论 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-111页 |
| 致谢 | 第111-113页 |
| 附录A | 第113-114页 |
| 附录B | 第114-115页 |
| 作者简历 | 第115-116页 |
