| 摘要 | 第5-6页 |
| abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第11-25页 |
| 1.1 荧光素酶的概述 | 第11-20页 |
| 1.1.1 荧光素酶的性质与发光原理 | 第11-13页 |
| 1.1.2 甲虫荧光素酶的分类和萤火虫荧光素酶 | 第13-14页 |
| 1.1.3 萤火虫荧光素酶的起源 | 第14页 |
| 1.1.4 萤火虫荧光素酶的应用领域 | 第14-16页 |
| 1.1.5 萤火虫荧光素酶的研究历史与现状 | 第16-19页 |
| 1.1.6 荧光素酶的制备工艺 | 第19-20页 |
| 1.2 毕赤酵母蛋白表达系统 | 第20-22页 |
| 1.2.1 毕赤酵母发展过程 | 第20页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统的优势 | 第20-21页 |
| 1.2.3 AOX1启动子 | 第21页 |
| 1.2.4 毕赤酵母的胞外分泌特性 | 第21-22页 |
| 1.2.5 毕赤酵母的糖基化修饰 | 第22页 |
| 1.3 本论文立题依据和研究内容 | 第22-25页 |
| 1.3.1 立题依据 | 第22-23页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第23-25页 |
| 第二章 荧光素酶基因的克隆与表达 | 第25-47页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料与仪器 | 第25-29页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第25-27页 |
| 2.2.2 主要试剂与酶 | 第27页 |
| 2.2.3 培养基和溶液配制 | 第27-28页 |
| 2.2.4 引物设计和合成 | 第28页 |
| 2.2.5 主要仪器与设备 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-38页 |
| 2.3.1 北美萤火虫荧光素酶基因luc和lucM的扩增和鉴定 | 第29-31页 |
| 2.3.2 荧光素酶表达载体的构建 | 第31-34页 |
| 2.3.3 重组质粒转化毕赤酵母GS115及阳性转化子的鉴定 | 第34-36页 |
| 2.3.4 荧光素酶的诱导表达和酶活鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物 | 第37页 |
| 2.3.6 ATP生物发光检测表达产物 | 第37-38页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第38-45页 |
| 2.4.1 荧光素酶基因luc和lucM的扩增 | 第38页 |
| 2.4.2 毕赤酵母真核表达载体的构建和验证 | 第38-40页 |
| 2.4.3 重组表达载体转化毕赤酵母和重组酵母的验证 | 第40-41页 |
| 2.4.5 两株重组菌的生长曲线测定 | 第41页 |
| 2.4.6 ATP发光测试检测表达产物 | 第41-43页 |
| 2.4.7 SDS-PAGE鉴定表达产物 | 第43-44页 |
| 2.4.8 讨论 | 第44-45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-47页 |
| 第三章 荧光素酶的纯化 | 第47-59页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 材料与仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 | 第47-48页 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 | 第48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-51页 |
| 3.3.1 重组菌GS115/pPIC9K-luc的摇瓶表达 | 第48页 |
| 3.3.2 胞外分泌的荧光素酶的纯化 | 第48-50页 |
| 3.3.3 胞内荧光素酶的纯化 | 第50页 |
| 3.3.4 重组菌GS115/pPICZαA-luc的摇瓶表达 | 第50页 |
| 3.3.5 胞外和胞内荧光素酶的纯化 | 第50-51页 |
| 3.3.6 大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-luc表达的荧光素酶 | 第51页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第51-58页 |
| 3.4.1 重组菌GS115/pPIC9K-luc的表达和纯化 | 第51-54页 |
| 3.4.2 重组菌GS115/pPICZαA-lucM的表达和纯化 | 第54-56页 |
| 3.4.3 大肠杆菌和毕赤酵母表达系统比较 | 第56-57页 |
| 3.4.4 讨论 | 第57-58页 |
| 3.5 本章小结 | 第58-59页 |
| 第四章 荧光素酶的酶活影响因素及其稳定性分析 | 第59-74页 |
| 4.1 引言 | 第59页 |
| 4.2 材料与仪器 | 第59-60页 |
| 4.2.1 材料 | 第59页 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 | 第59-60页 |
| 4.3 实验方法 | 第60-64页 |
| 4.3.1 去糖基化 | 第60页 |
| 4.3.2 ATP发光反应衰减曲线 | 第60-61页 |
| 4.3.3 ATP浓度与发光强度的关系 | 第61页 |
| 4.3.4 D-荧光素浓度对发光的影响 | 第61页 |
| 4.3.5 不同浓度反应组分、反应环境对发光强度的影响 | 第61-63页 |
| 4.3.6 毕赤酵母源荧光素酶的稳定性研究 | 第63-64页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第64-72页 |
| 4.4.1 荧光素酶的糖基化测定 | 第64-65页 |
| 4.4.2 ATP生物发光衰减曲线 | 第65页 |
| 4.4.3 ATP浓度与发光强度的关系 | 第65-67页 |
| 4.4.4 荧光素浓度与发光强度的关系 | 第67-68页 |
| 4.4.5 不同浓度反应组分、反应环境对发光强度的影响 | 第68-69页 |
| 4.4.6 毕赤酵母源荧光素酶的稳定性研究 | 第69-71页 |
| 4.4.7 讨论 | 第71-72页 |
| 4.5 本章小结 | 第72-74页 |
| 结论与展望 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-84页 |
| 附录：本文中英文缩写对照表 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 附件 | 第87页 |
