| 第一部分 通过筛选过表达省略抑制子研究粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe必需基因缺失的可弥补性 | 第6-71页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 引言 | 第10-27页 |
| 1.1 必需基因的定义及其特性 | 第10-11页 |
| 1.2 粟酒裂殖酵母S.pombe及其必需基因的介绍 | 第11-12页 |
| 1.3 遗传相互作用以及省略抑制子的定义 | 第12-14页 |
| 1.4 系统性遗传相互作用的研究及其意义 | 第14-18页 |
| 1.5 对生物网络结构的理解以及非必需基因与必需基因在生物网络中的特征 | 第18-21页 |
| 1.6 基因过表达会产生什么生物学效果?过表达表型出现的几种可能机理 | 第21-23页 |
| 1.7 过表达介导的遗传相互作用研究情况 | 第23-24页 |
| 1.8 本研究目的与意义 | 第24-27页 |
| 第二章 实验仪器与试剂 | 第27-31页 |
| 2.1 实验仪器 | 第27页 |
| 2.2 实验试剂 | 第27-29页 |
| 2.2.1 普通实验试剂 | 第27-28页 |
| 2.2.2 酵母培养基用试剂 | 第28页 |
| 2.2.3 酵母培养基配制 | 第28-29页 |
| 2.2.4 酵母转化试剂配制 | 第29页 |
| 2.2.5 碱裂解法提取质粒试剂配制 | 第29页 |
| 2.2.6 其他试剂配制 | 第29页 |
| 2.3 本实验所使用的菌株 | 第29-31页 |
| 第三章 实验方法 | 第31-42页 |
| 3.1 构建过表达省略抑制筛选的query菌株O-BOE query strains) | 第31-32页 |
| 3.2 提取过表达质粒文库 | 第32-34页 |
| 3.3 构建过表达酵母文库 | 第34页 |
| 3.4 筛选过表达省略抑制子 | 第34-35页 |
| 3.5 制备O-BOE高通量测序样品 | 第35-38页 |
| 3.6 分析高通量测序实验结果 | 第38-39页 |
| 3.7 通过实验验证筛选得到的过表达省略抑制子 | 第39-40页 |
| 3.8 半定量分析比较必需基因省略抑制子之间的生长强弱 | 第40-41页 |
| 3.9 验证过表达省略抑制子是否依赖于其C端的YFH标签 | 第41页 |
| 3.10 RNA提取与测序 | 第41页 |
| 3.11 数据处理 | 第41-42页 |
| 第四章 实验结果 | 第42-67页 |
| 4.1 过表达酵母文库可有效包含5.pombe ORFeome过表达质粒文库的信息 | 第42-43页 |
| 4.2 O-BOE筛选系统可有效富集过表达抑制子 | 第43-46页 |
| 4.3 S.pombe中约12.5%的必需基因可通过过表达Yoshida质粒省略抑制 | 第46-47页 |
| 4.4 S.pombe必需基因的过表达省略抑制遗传关系富集与必需基因参与相同生物学过程的基因 | 第47-49页 |
| 4.5 可被过表达质粒省略抑制的必需基因相较于不能省略抑制的必需基因拥有更低的蛋白表达量 | 第49-52页 |
| 4.6 可被过表达质粒省略抑制的必需基因相较于没有OP-BOE的必需基因保守性更低、进化速率更快 | 第52-55页 |
| 4.7 过表达质粒省略抑制子的特征 | 第55-61页 |
| 4.7.1 约1/3的过表达省略抑制子依赖其C端的YFH标签发挥作用 | 第55-58页 |
| 4.7.2 OPAD省略抑制子主要为蛋白复合体中的蛋白 | 第58-61页 |
| 4.8 过表达省略抑制子可帮助揭示基因的必需功能 | 第61-67页 |
| 4.8.1 Res1通过控制Cdc18的表达调控S.pombe的细胞周期 | 第61-63页 |
| 4.8.2 ERMES复合体的必需功能与脂类代谢过程以及细胞壁合成有关 | 第63-67页 |
| 第五章 小结与讨论 | 第67-71页 |
| 5.1 过表达质粒文库与过表达省略抑制子 | 第67-68页 |
| 5.2 过表达省略抑制筛选系统的鲁棒性 | 第68-69页 |
| 5.3 过表达省略抑制关系 | 第69-70页 |
| 5.4 paralogous基因对必需基因的省略抑制 | 第70页 |
| 5.5 可被省略抑制的必需基因与不可被省略抑制的必需基因 | 第70-71页 |
| 第二部分 探索SUMO靶向泛素连接酶Slx8-Rfp1/Rfp2在粟酒裂殖酵母中的必需功能 | 第71-127页 |
| 摘要 | 第71-73页 |
| Abstract | 第73-75页 |
| 第一章 引言 | 第75-87页 |
| 1.1 SUMO修饰系统 | 第75-77页 |
| 1.2 Slx8的发现及其生化活性 | 第77-79页 |
| 1.3 细胞内STUbL底物的研究进展 | 第79-81页 |
| 1.4 核孔复合体与SUMO修饰系统的关系 | 第81-85页 |
| 1.5 在粟酒裂殖酵母S.pombe中Slx8的研究进展及本研究的研究目的和意义 | 第85-87页 |
| 第二章 实验试剂与仪器 | 第87-95页 |
| 2.1 实验试剂 | 第87-95页 |
| 2.1.1 普通试剂 | 第87页 |
| 2.1.2 酵母培养基配制 | 第87-88页 |
| 2.1.3 酵母转化试剂配制 | 第88页 |
| 2.1.4 蛋白实验试剂 | 第88页 |
| 2.1.5 其他试剂配制 | 第88-89页 |
| 2.1.6 实验仪器 | 第89页 |
| 2.1.7 主要使用的质粒 | 第89-91页 |
| 2.1.8 主要使用的酵母菌株 | 第91-95页 |
| 第三章 实验方法 | 第95-98页 |
| 3.1 酵母转化 | 第95页 |
| 3.2 四分子分析 | 第95页 |
| 3.3 用碱裂解和三氯乙酸提取蛋白 | 第95页 |
| 3.4 在大肠杆菌中重组表达并提取Pmt3GG(成熟的Pmt3形式)蛋白 | 第95-96页 |
| 3.5 蛋白质的亲和纯化及质谱分析 | 第96-97页 |
| 3.6 蛋白质印迹杂交 | 第97页 |
| 3.7 亲和纯化细胞中被SUMO修饰的蛋白及其质谱鉴定 | 第97-98页 |
| 第四章 实验结果 | 第98-120页 |
| 4.1 遗传筛选发现在S.pombe中Slx8的必需功能可被多个基因突变体省略抑制 | 第98-100页 |
| 4.2 slx8的省略抑制子分属于几种不同的信号通路 | 第100-103页 |
| 4.3 Nup107核孔复合体可能通过调节去SUMO修饰蛋白酶Ulp1的定位参与Slx8必需功能的省略抑制 | 第103-107页 |
| 4.4 内源表达的Ulp1在Slx8缺失时可导致细胞死亡 | 第107-113页 |
| 4.5 Rrp2的多个功能区域参与slx8△的致死过程 | 第113-116页 |
| 4.6 Slx8省略抑制子可影响Rrp2在细胞核内成点的能力 | 第116-117页 |
| 4.7 Rrp2蛋白N端不同形式突变体的过表达可回补slx8缺失引起的死亡表型 | 第117-120页 |
| 第五章 小结与讨论 | 第120-127页 |
| 5.1 Ulp1的省略抑制功能以及其与核孔复合体运输的关系 | 第120-121页 |
| 5.2 Rrp2的省略抑制功能及其与Rrp1的关系 | 第121-122页 |
| 5.3 Rrp2与Ulp1在省略抑制slx8必需功能上的关系 | 第122-123页 |
| 5.4 Slx8-Rfp1/Rfp2与Ufd1-Cdc48-Npl4复合体之间的关系 | 第123-124页 |
| 5.5 Slx8的过表达省略抑制子及其与染色体结构的关系 | 第124-127页 |
| 参考文献 | 第127-134页 |
| 附录 | 第134-146页 |
| 附表1 过表达省略抑制筛选的必需基因 | 第134-140页 |
| 附表2 必需基因及其过表达省略抑制子 | 第140-146页 |
| 致谢 | 第146-148页 |
