| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略语 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述和实验方案设计 | 第13-19页 |
| 1 膜蛋白研究概述和面临的困难 | 第13-14页 |
| 2 多角体蛋白（Polh）的研究概况 | 第14-15页 |
| 3 昆虫杆状病毒表达系统的研究概况 | 第15-16页 |
| 3.1 昆虫杆状病毒表达系统研究概况 | 第15页 |
| 3.2 家蚕杆状病毒表达系统的优势 | 第15-16页 |
| 4 实验方案设计 | 第16-19页 |
| 4.1 实验目的和意义 | 第16-17页 |
| 4.2 实验的主要内容 | 第17-18页 |
| 4.3 实验流程 | 第18-19页 |
| 第二章 生物信息学分析 | 第19-28页 |
| 1 生物信息学分析工具 | 第19页 |
| 2 分析方法与结果 | 第19-26页 |
| 2.1 家蚕 BmBCRA 基因序列 | 第19-20页 |
| 2.2 保守结构域预测 | 第20页 |
| 2.3 二级结构预测 | 第20-21页 |
| 2.4 同源性分析 | 第21-22页 |
| 2.5 进化树构建 | 第22-23页 |
| 2.6 疏水性分析 | 第23-24页 |
| 2.7 跨膜区预测 | 第24页 |
| 2.8 信号肽预测 | 第24-25页 |
| 2.9 蛋白定位分析 | 第25页 |
| 2.10 高级结构预测 | 第25-26页 |
| 2.11 功能位点预测 | 第26页 |
| 3 讨论 | 第26-28页 |
| 第三章 膜蛋白 BmBCRA 基因的克隆、表达纯化和结晶初探 | 第28-50页 |
| 1 材料和试剂 | 第28-32页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第28-29页 |
| 1.2 主要试剂的配制 | 第29-32页 |
| 2 方法 | 第32-42页 |
| 2.1 家蚕蛹 cDNA 的合成和重组表达载体 pET-32a-BmBCRA 的构建 | 第32-35页 |
| 2.2 重组表达载体 pET-32a-Polh-BmBCRA 的构建 | 第35-36页 |
| 2.3 两种重组表达载体在大肠杆菌中的表达 | 第36-37页 |
| 2.4 融合蛋白 Polh-BmBCRA 表达的 SDS-PAGE 分析 | 第37-38页 |
| 2.5 融合蛋白 Polh-BmBCRA 表达的 Western blotting 鉴定 | 第38-39页 |
| 2.6 融合蛋白 Polh-BmBCRA 的调 pH 纯化和定量 | 第39-40页 |
| 2.7 融合蛋白 Polh-BmBCRA 质谱鉴定 | 第40-41页 |
| 2.8 融合蛋白 Polh-BmBCRA 的结晶条件初筛 | 第41页 |
| 2.9 融合蛋白 Polh-BmBCRA 的 TEV 酶切分析 | 第41-42页 |
| 3.结果 | 第42-48页 |
| 3.1 BmBCRA 基因的扩增和表达载体 pET-32a-BmBCRA 的构建 | 第42-43页 |
| 3.2 Polh 基因的扩增和表达载体 pET-32a-Polh-BmBCRA 的构建 | 第43-44页 |
| 3.3 pET-32a-BmBCRA 和 pET-32a-Polh-BmBCRA 的原核表达 | 第44-45页 |
| 3.4 融合蛋白 Polh-BmBCRA 的 Western blotting 鉴定 | 第45-46页 |
| 3.5 调 pH 和高速离心纯化融合蛋白 | 第46页 |
| 3.6 融合蛋白 Polh-BmBCRA 的质谱鉴定 | 第46-47页 |
| 3.7 融合蛋白 Polh-BmBCRA 结晶条件初筛 | 第47-48页 |
| 3.8 融合蛋白 Polh-BmBCRA 的 TEV 酶切分析 | 第48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 第四章 多角体融合蛋白 Polh-BmBCRA 的多克隆抗体制备 | 第50-55页 |
| 1 材料和试剂 | 第50-51页 |
| 1.1 材料 | 第50页 |
| 1.2 试剂 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-52页 |
| 2.1 抗原的制备 | 第51页 |
| 2.2 新西兰大白兔的免疫和多克隆抗体的制备 | 第51页 |
| 2.3 间接 ELISA 测定抗体效价 | 第51-52页 |
| 2.4 抗体特异性的 Western blotting 鉴定 | 第52页 |
| 2.5 抗体的纯化 | 第52页 |
| 3 结果 | 第52-54页 |
| 3.1 抗体效价测定 | 第52-53页 |
| 3.2 抗体特异性检测 | 第53页 |
| 3.3 抗体纯化 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 第五章 膜蛋白 BmBCRA 在家蚕细胞中的表达和亚细胞定位分析 | 第55-70页 |
| 1 材料和试剂 | 第55-56页 |
| 1.1 材料和主要试剂 | 第55页 |
| 1.2 试剂配制 | 第55-56页 |
| 2 方法 | 第56-62页 |
| 2.1 重组质粒 pFastBacHTA-BmBCRA 和 pFastBacHTB-Polh-BmBCRA 的构建 | 第56-57页 |
| 2.2 重组病毒基因组 Bacmid-BmBCRA 与 Bacmid-Polh-BmBCRA 的构建 | 第57-59页 |
| 2.3 家蚕 BmN 细胞的复苏和贴壁培养 | 第59-60页 |
| 2.4 重组病毒 vPolh-BmBCRA 和 vBmBCRA 的构建 | 第60-61页 |
| 2.5 融合蛋白 Polh-BmBCRA 在家蚕 BmN 细胞中的表达和鉴定 | 第61页 |
| 2.6 重组病毒 vEGFP 和 vBmBCRA-EGFP 的构建及 BmBCRA 的亚细胞定位 | 第61-62页 |
| 3 结果 | 第62-69页 |
| 3.1 重组质粒 pFastBacHTB-Polh-BmBCRA 和 pFastBacHTA-BmBCRA 的构建 | 第62-63页 |
| 3.2 重组 Bacmid 的鉴定 | 第63-64页 |
| 3.3 重组病毒 vBmBCRA 与 vPolh-BmBCRA 的鉴定 | 第64-65页 |
| 3.4 膜蛋白 BmBCRA 和融合蛋白 Polh-BmBCRA 的真核表达 | 第65-67页 |
| 3.5 重组病毒 vEGFP 与 vBmBCRA-EGFP 的构建和鉴定 | 第67-68页 |
| 3.6 膜蛋白 BmBCRA 的亚细胞定位 | 第68-69页 |
| 4 讨论 | 第69-70页 |
| 第六章 BmBCRA 基因在家蚕各个组织中的转录差异性分析 | 第70-77页 |
| 1 材料、试剂和仪器设备 | 第70页 |
| 2 荧光定量 PCR 引物设计 | 第70-71页 |
| 3 方法 | 第71-73页 |
| 3.1 各组织总 RNA 的提取 | 第71页 |
| 3.2 cDNA 第一链的合成 | 第71页 |
| 3.3 荧光定量 PCR | 第71-72页 |
| 3.4 荧光定量 PCR 数据分析 | 第72-73页 |
| 4 结果 | 第73-75页 |
| 4.1 家蚕各组织中内参和 BmBCRA 的 RT-PCR 曲线分析 | 第73-74页 |
| 4.2 家蚕各组织中 BmBCRA 的转录水平分析 | 第74-75页 |
| 5 讨论 | 第75-77页 |
| 第七章 BmBCRA 基因的 RNAi 对家蚕细胞活性及细胞凋亡的影响 | 第77-86页 |
| 1 材料与试剂 | 第77-78页 |
| 1.1 材料设备和试剂 | 第77页 |
| 1.2 试剂的配制 | 第77-78页 |
| 2 方法 | 第78-81页 |
| 2.1 双链 RNA（dsRNA）的体外合成 | 第78-79页 |
| 2.2 dsRNA 的脂质体转染 | 第79-80页 |
| 2.3 BmBCRA 基因干扰后家蚕 BmN 细胞活力变化的 MTT 检测 | 第80页 |
| 2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 | 第80-81页 |
| 3 结果 | 第81-84页 |
| 3.1 dsRNA 的合成和浓度测定 | 第81-82页 |
| 3.2 细胞活力变化的 MTT 检测 | 第82-83页 |
| 3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 | 第83-84页 |
| 4 讨论 | 第84-86页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-90页 |
| 致谢 | 第90页 |
