| 摘要 | 第7-12页 |
| ABSTRACT | 第12-18页 |
| 缩略符号表 | 第19-21页 |
| 第一章 绪论 | 第21-34页 |
| 1.1 利用酿酒酵母进行木质纤维素原料乙醇生产的意义 | 第21-22页 |
| 1.2 酿酒酵母戊糖转运蛋白的研究进展 | 第22-27页 |
| 1.2.1 戊糖转运蛋白的类型 | 第22-23页 |
| 1.2.2 酿酒酵母木糖转运蛋白的研究 | 第23-26页 |
| 1.2.3 酿酒酵母L-阿拉伯糖转运蛋白的研究 | 第26-27页 |
| 1.3 酿酒酵母代谢L-阿拉伯糖生产乙醇的研究进展 | 第27-32页 |
| 1.3.1 真菌L-阿拉伯糖代谢途径的研究 | 第28-29页 |
| 1.3.2 细菌L-阿拉伯糖代谢途径的研究 | 第29-31页 |
| 1.3.3 葡萄糖、木糖和L-阿拉伯糖混糖代谢重组菌株的研究 | 第31-32页 |
| 1.4 本论文研究意义及主要内容 | 第32-34页 |
| 第二章 材料与方法 | 第34-43页 |
| 2.1 材料 | 第34-35页 |
| 2.1.1 实验用到的酶和试剂 | 第34页 |
| 2.1.2 培养基 | 第34-35页 |
| 2.2 普通微生物学技术 | 第35-36页 |
| 2.2.1 菌体的生长 | 第35页 |
| 2.2.2 菌种的保存 | 第35页 |
| 2.2.3 酿酒酵母菌株的生长曲线测定 | 第35-36页 |
| 2.2.4 平板梯度生长实验 | 第36页 |
| 2.3 分子生物学方法 | 第36-40页 |
| 2.3.1 DNA的合成和序列测定 | 第36页 |
| 2.3.2 PCR反应和琼脂糖凝胶电泳 | 第36页 |
| 2.3.3 DNA纯化和浓度的测定 | 第36页 |
| 2.3.4 限制性核酸内切酶的酶切反应 | 第36页 |
| 2.3.5 质粒构建与大肠杆菌转化 | 第36页 |
| 2.3.6 大肠杆菌中质粒的提取 | 第36-37页 |
| 2.3.7 酿酒酵母LiAc完整细胞转化法 | 第37页 |
| 2.3.8 酿酒酵母染色体的提取 | 第37页 |
| 2.3.9 酿酒酵母质粒的提取 | 第37页 |
| 2.3.10 酿酒酵母总RNA的提取和cDNA的制备 | 第37-38页 |
| 2.3.11 实时荧光定量PCR | 第38页 |
| 2.3.12 G418抗性筛选标记(KanMX4)的去除 | 第38页 |
| 2.3.13 定点突变 | 第38-39页 |
| 2.3.14 木糖苷酶的酶活测定 | 第39页 |
| 2.3.15 荧光显微图片 | 第39-40页 |
| 2.4 菌株代谢能力测试 | 第40-41页 |
| 2.4.1 高密度分批摇瓶培养 | 第40页 |
| 2.4.2 L-阿拉伯糖分批摇瓶培养和厌氧发酵罐培养 | 第40-41页 |
| 2.4.3 代谢产物分析 | 第41页 |
| 2.5 驯化培养 | 第41页 |
| 2.6 木糖和L-阿拉伯糖胞内积累量的测试 | 第41-42页 |
| 2.7 木糖质子同向型转运蛋白的检测 | 第42页 |
| 2.8 转运蛋白Mgt05196p的同源模建和木糖分子对接 | 第42-43页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第43-113页 |
| 第一部分 木糖转运蛋白高通量筛选方法的建立与应用 | 第43-58页 |
| 3.1 基于pNPX的木糖转运蛋白筛选模型的建立 | 第46-55页 |
| 3.1.1 木糖苷酶基因的克隆和表达载体的构建 | 第46-48页 |
| 3.1.2 木糖苷酶酶活的测定 | 第48页 |
| 3.1.3 全细胞测定条件下胞内外pNP含量的测定 | 第48-50页 |
| 3.1.4 木糖苷酶酶活与孵育时间的关系 | 第50页 |
| 3.1.5 pNPX与木糖、葡萄糖转运关系的测定 | 第50-52页 |
| 3.1.6 超表达转运蛋白AraEp、HXT7p和Gal2p对菌株转运能力的影响 | 第52-55页 |
| 3.2 AraEp突变子的高通量筛选 | 第55-57页 |
| 本部分小结 | 第57-58页 |
| 第二部分 异源戊糖转运蛋白的筛选与功能研究 | 第58-100页 |
| 3.3 葡萄糖和戊糖同步利用菌株的特性研究 | 第72-74页 |
| 3.3.1 T. cutaneum的糖同步代谢能力验证 | 第72-73页 |
| 3.3.2 M. guilliermondii的糖同步代谢能力验证 | 第73-74页 |
| 3.4 异源戊糖转运蛋白的克隆和表达 | 第74-78页 |
| 3.5 戊糖转运蛋白的进化树分析 | 第78-80页 |
| 3.6 转运蛋白的戊糖和己糖转运能力测试 | 第80-82页 |
| 3.7 木糖转运蛋白对hxt null木糖代谢菌株的木糖生长能力的影响 | 第82-84页 |
| 3.8 转运蛋白Mgt05196p的细胞膜定位 | 第84-85页 |
| 3.9 木糖转运蛋白类型的测定 | 第85-86页 |
| 3.10 Mgt05196p表达菌株的高密度摇瓶测试 | 第86-89页 |
| 3.11 转运蛋白Mgt05196p的木糖转运功能位点分析 | 第89-97页 |
| 3.11.1 Mgt05196p转运蛋白的同源模建和木糖分子对接 | 第89-90页 |
| 3.11.2 Mgt05196p糖转运相关保守氨基酸位点的选择 | 第90页 |
| 3.11.3 Mgt05196p上木糖转运活性位点的验证 | 第90-97页 |
| 本部分小结 | 第97-100页 |
| 第三部分 L-阿拉伯糖代谢途径的构建与优化 | 第100-113页 |
| 3.12 L-阿拉伯糖代谢菌株的获得 | 第103-105页 |
| 3.13 基因工程改造并结合适应性进化策略提高菌株的L-阿拉伯糖代谢能力 | 第105-109页 |
| 3.14 超表达内源转运蛋白Gal2p显著提高菌株的L-阿拉伯糖发酵能力 | 第109-111页 |
| 本部分小结 | 第111-113页 |
| 全文总结与展望 | 第113-116页 |
| 附录 | 第116-126页 |
| 参考文献 | 第126-135页 |
| 致谢 | 第135-137页 |
| 攻读学位期间的学术成果 | 第137-139页 |
| 附件 | 第139-165页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第165页 |
