| 第一部分 碳青霉烯类抗生素体外抗菌活性及其耐药机制研究 | 第1-61页 |
| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 前言 | 第9-10页 |
| 一、实验材料 | 第10-15页 |
| 1 菌株和质粒 | 第10页 |
| 2 培养基 | 第10页 |
| 3 试剂和药品 | 第10-11页 |
| 4 缓冲液 | 第11-13页 |
| 5 仪器设备 | 第13-15页 |
| 二、实验方法 | 第15-28页 |
| 1 实验室菌种的冻存 | 第15页 |
| 2 质粒DNA的提取 | 第15页 |
| 3 DNA片段的回收 | 第15-16页 |
| 4 用氯化钙法制备感受态细胞 | 第16页 |
| 5 质粒转化感受态细胞 | 第16页 |
| 6 菌落快速裂解鉴定 | 第16-17页 |
| 7 琼脂二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC) | 第17页 |
| 8 碳青霉烯酶基因的引物设计及PCR筛选 | 第17-18页 |
| 9 VIM-2、OXA-23、NDM-1基因引物设计及PCR扩增 | 第18-20页 |
| 10 NDM-1M与NDM-1F克隆质粒的构建 | 第20-21页 |
| 11 VIM-2、OXA-23表达质粒的构建 | 第21-22页 |
| 12 VIM-2、OXA-23表达菌株的构建 | 第22页 |
| 13 诱导靶蛋白表达的优化 | 第22页 |
| 14 细菌菌体的收集及超声破碎 | 第22-23页 |
| 15 蛋白样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第23-24页 |
| 16 对蛋白胶进行考马斯亮蓝快速染色 | 第24页 |
| 17 使用AKTA系统纯化蛋白 | 第24-25页 |
| 18 使用PD-10脱盐柱对蛋白进行脱盐处理 | 第25页 |
| 19 使用Bradford法测定蛋白浓度 | 第25-26页 |
| 20 酶标仪测定酶的水解特性 | 第26-28页 |
| 三、实验结果 | 第28-56页 |
| 1 四种碳青霉烯类抗生素对临床分离菌的MIC值 | 第28-37页 |
| 2 碳青霉烯酶基因的PCR筛选结果 | 第37-39页 |
| 3 VIM-2、OXA-23、NDM-1M和NDM-1F片段温度梯度PCR | 第39-41页 |
| 4 NDM-1M与NDM-1F克隆质粒的构建与鉴定 | 第41-44页 |
| 5 VIM-2与OXA-23表达质粒的构建和鉴定 | 第44-46页 |
| 6 VIM-2与OXA-23表达菌株的构建和鉴定 | 第46-48页 |
| 7 诱导VIM-2与OXA-23蛋白表达及纯化 | 第48-52页 |
| 8 VIM-2与OXA-23蛋白的水解特性测定 | 第52-56页 |
| 四、讨论与结论 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-61页 |
| 第二部分 重组大肠埃希菌AcrAB外排泵的构建 | 第61-89页 |
| 摘要 | 第63-64页 |
| Abstract | 第64-65页 |
| 前言 | 第65-66页 |
| 一、实验材料 | 第66-69页 |
| 1 菌株和质粒 | 第66页 |
| 2 培养基 | 第66页 |
| 3 试剂和药品 | 第66-67页 |
| 4 缓冲液 | 第67-68页 |
| 5 仪器设备 | 第68-69页 |
| 二、实验方法 | 第69-77页 |
| 1 实验室菌种的冻存 | 第69页 |
| 2 大肠埃希菌K12基因组DNA的提取 | 第69页 |
| 3 质粒DNA的提取 | 第69-70页 |
| 4 DNA片段的回收 | 第70页 |
| 5 用氯化钙法制备感受态细胞 | 第70页 |
| 6 质粒转化感受态细胞 | 第70-71页 |
| 7 菌落快速裂解鉴定 | 第71页 |
| 8 引物设计及PCR扩增 | 第71-72页 |
| 9 acrAB表达质粒的构建 | 第72-73页 |
| 10 acrAB表达模型的构建 | 第73页 |
| 11 微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC) | 第73-74页 |
| 12 诱导靶蛋白表达的优化 | 第74页 |
| 13 细菌菌体的收集与超声破碎 | 第74-75页 |
| 14 蛋白样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第75-76页 |
| 15 对蛋白胶进行考马斯亮蓝快速染色 | 第76-77页 |
| 三、结果与讨论 | 第77-87页 |
| 1 大肠埃希菌K12基因组DNA的提取 | 第77页 |
| 2 acrAB温度梯度PCR扩增结果 | 第77-78页 |
| 3 acrAB表达质粒的构建和鉴定 | 第78-83页 |
| 4 acrAB表达模型的构建和鉴定 | 第83页 |
| 5 MIC测定结果 | 第83-86页 |
| 6 诱导蛋白表达结果 | 第86-87页 |
| 四、结论 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-89页 |
| 文献综述1 | 第89-103页 |
| 参考文献 | 第96-103页 |
| 文献综述2 | 第103-113页 |
| 参考文献 | 第108-113页 |
| 发表文章 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 附录 | 第115-123页 |
