| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 缩略表 | 第5-9页 |
| 一、引言 | 第9-13页 |
| 1 细菌OEP基因的研究进展 | 第9-12页 |
| 1.1 结构特征 | 第9-10页 |
| 1.1.1 TolC结构特征 | 第9-10页 |
| 1.1.2 OprM结构特征 | 第10页 |
| 1.2 与RND外排泵中另外两种组分蛋白质的相互作用 | 第10-11页 |
| 1.3 在RND外排泵中的功能及其它方面的作用 | 第11-12页 |
| 2 选题的目的及意义 | 第12-13页 |
| 二、试验研究 | 第13-40页 |
| 1 材料 | 第13-15页 |
| 1.1 菌种 | 第13页 |
| 1.2 主要试剂 | 第13页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第13-14页 |
| 1.3.1 基因克隆相关试剂的配制 | 第13页 |
| 1.3.2 基因表达相关试剂的配制 | 第13-14页 |
| 1.3.3 Westem-Blot相关试剂 | 第14页 |
| 1.3.4 抗体制备及粗提相关试剂 | 第14页 |
| 1.4 主要仪器 | 第14-15页 |
| 2 方法 | 第15-23页 |
| 2.1 RA OEP基因及编码氨基酸序列的生物信息学分析 | 第15页 |
| 2.2 RA OEP基因PCR扩增和T克隆 | 第15-16页 |
| 2.2.1 RA基因组DNA提取 | 第15页 |
| 2.2.2 RA OEP基因的PCR扩增 | 第15-16页 |
| 2.3 重组原核表达质粒pET-32a(+)/OEP的构建及表达 | 第16-17页 |
| 2.3.1 重组原核表达质粒pET-32a(+)/OEP的构建 | 第16-17页 |
| 2.3.2 重组质粒pET-32a(+)/OEP的原核表达 | 第17页 |
| 2.4 RA OEP重组蛋白的诱导表达及条件优化 | 第17-19页 |
| 2.4.1 RA OEP重组蛋白的诱导表达 | 第17-18页 |
| 2.4.2 Western-blot法鉴定重组蛋白 | 第18-19页 |
| 2.4.3 RA OEP重组蛋白表达条件的优化 | 第19页 |
| 2.5 RA OEP重组蛋白的纯化 | 第19-20页 |
| 2.6 兔抗重组蛋白OEP多克隆抗体的制备 | 第20-21页 |
| 2.6.1 免疫程序 | 第20页 |
| 2.6.2 琼脂糖凝胶扩散实验检测制备的抗体的效价 | 第20页 |
| 2.6.3 血清的制备与保存 | 第20-21页 |
| 2.6.4 用饱和硫酸铵盐析法粗提兔抗RA OEP蛋白IgG | 第21页 |
| 2.7 荧光定量PCR法分析OEP基因表达量与RA耐四环素的关系 | 第21-23页 |
| 2.7.1 引物的设计与合成 | 第21页 |
| 2.7.2 标准曲线的绘制 | 第21-22页 |
| 2.7.3 RA MIC值的测定 | 第22页 |
| 2.7.4 RA的培养 | 第22页 |
| 2.7.5 Total RNA的抽提 | 第22页 |
| 2.7.6 RNA反转录成cDNA | 第22-23页 |
| 2.7.7 样品的定量检测 | 第23页 |
| 3 结果 | 第23-35页 |
| 3.1 生物信息学分析结果 | 第23-28页 |
| 3.1.1 RA OEP基因编码的氨基酸序列 | 第23页 |
| 3.1.2 RA OEP蛋白理化性质分析 | 第23-24页 |
| 3.1.3 RA OEP蛋白疏水性分析 | 第24页 |
| 3.1.4 RA OEP蛋白抗原表位分析 | 第24页 |
| 3.1.5 RA OEP蛋白功能位点分析 | 第24页 |
| 3.1.6 RA OEP蛋白磷酸化位点预测分析 | 第24-25页 |
| 3.1.7 RA OEP蛋白N-糖基化位点预测分析 | 第25页 |
| 3.1.8 RA OEP蛋白亚细胞定位分析 | 第25页 |
| 3.1.9 RA OEP蛋白保守结构域预测 | 第25-26页 |
| 3.1.10 RA OEP蛋白信号肽预测 | 第26页 |
| 3.1.11 RA OEP蛋白跨膜区预测 | 第26页 |
| 3.1.12 RA OEP基因稀有密码子分析 | 第26-27页 |
| 3.1.13 RA OEP基因系统进化树分析 | 第27-28页 |
| 3.1.14 RA OEP基因密码子偏嗜性分析 | 第28页 |
| 3.2 RA OEP基因PCR扩增及T克隆酶切鉴定 | 第28-30页 |
| 3.3 重组表达质粒pET-32a(+)/OEP的构建及鉴定 | 第30页 |
| 3.4 RA OEP重组蛋白的诱导表达及优化 | 第30-32页 |
| 3.4.1 RA OEP重组蛋白的诱导表达 | 第30-31页 |
| 3.4.2 IPTG浓度的优化 | 第31页 |
| 3.4.3 诱导时间的优化 | 第31页 |
| 3.4.4 诱导温度的优化 | 第31-32页 |
| 3.4.5 重组OEP蛋白的纯化 | 第32页 |
| 3.4.6 Westem-blot法检测重组OEP蛋白 | 第32页 |
| 3.5 兔抗RA OEP抗体效价检测与抗体IgG的粗提 | 第32-33页 |
| 3.6 荧光定量PCR法分析OEP基因表达量与RA耐四环素的关系 | 第33-35页 |
| 3.6.1 RA OEP基因与β-action基因标准曲线的绘制 | 第33页 |
| 3.6.2 RA MIC值的测定 | 第33-34页 |
| 3.6.3 Total RNA完整性检测 | 第34页 |
| 3.6.4 基因OEP表达量与RA耐四环素的研究分析 | 第34-35页 |
| 4 讨论 | 第35-40页 |
| 4.1 生物信息学分析 | 第35-36页 |
| 4.2 重组蛋白pET-32a(+)/OEP的表达及多克隆抗体的制备 | 第36-38页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第36页 |
| 4.2.2 RA重组OEP蛋白的原核表达 | 第36-37页 |
| 4.2.3 重组蛋白表达条件的优化 | 第37页 |
| 4.2.4 重组蛋白的纯化 | 第37页 |
| 4.2.5 重组OEP蛋白抗原的制备 | 第37-38页 |
| 4.3 RA OEP基因表达量与RA耐四环素关系的初步研究 | 第38-40页 |
| 4.3.1 引物设计 | 第38页 |
| 4.3.2 内参基因的选择 | 第38页 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR | 第38-40页 |
| 三、结论 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第46页 |
