| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 1 绪论 | 第21-43页 |
| 1.1 糖基水解酶18家族几丁质酶 | 第22-33页 |
| 1.1.1 GH18家族几丁质酶的分布与功能 | 第22-25页 |
| 1.1.2 GH18家族几丁质酶结构与功能关系 | 第25-30页 |
| 1.1.3 GH18家族几丁质酶的催化机理 | 第30-33页 |
| 1.2 GH18家族几丁质酶抑制剂 | 第33-41页 |
| 1.2.1 Allosamidin | 第33-34页 |
| 1.2.2 Argifm和argadin | 第34-37页 |
| 1.2.3 甲基黄嘌呤衍生物 | 第37-39页 |
| 1.2.4 其他抑制剂 | 第39-41页 |
| 1.3 本论文的选题依据和研究策略 | 第41-43页 |
| 1.3.1 选题依据 | 第41页 |
| 1.3.2 研究策略 | 第41-43页 |
| 2 OfChtI-CAD的重组表达与纯化 | 第43-51页 |
| 2.1 引言 | 第43页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第43-46页 |
| 2.2.1 OfChtI蛋白稳定性的检测 | 第43页 |
| 2.2.2 蛋白序列分析与催化域位置的确定 | 第43-44页 |
| 2.2.3 OfChtI-CAD的基因克隆 | 第44-45页 |
| 2.2.4 两种OfChtI-CAD蛋白的诱导表达 | 第45页 |
| 2.2.5 两种OfChtI-CAD蛋白的分离纯化 | 第45-46页 |
| 2.2.6 OfChtI-CAD蛋白纯度的HPLC检测 | 第46页 |
| 2.3 实验结果 | 第46-49页 |
| 2.3.1 OfChtI蛋白稳定性的研究 | 第46页 |
| 2.3.2 OfChtI蛋白序列分析与催化域位置的确定 | 第46-48页 |
| 2.3.3 两种OfChtI-CAD蛋白的获得 | 第48页 |
| 2.3.4 HPLC检测OfhtI-CAD_(19-407)蛋白的纯度 | 第48-49页 |
| 2.4 分析讨论 | 第49-50页 |
| 2.5 小结 | 第50-51页 |
| 3 OfChtI-CAD晶体结构的研究 | 第51-66页 |
| 3.1 引言 | 第51页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第51-54页 |
| 3.2.1 OflChtI-CAD结晶条件的筛选 | 第51-52页 |
| 3.2.2 X-射线衍射数据收集 | 第52页 |
| 3.2.3 OfChtI-CAD晶体结构解析 | 第52页 |
| 3.2.4 OfChtI-CAD与其他几丁质酶的蛋白结构比对 | 第52页 |
| 3.2.5 OfChtI-CAD突变体的克隆、表达与纯化 | 第52-53页 |
| 3.2.6 酶学活性测定方法 | 第53-54页 |
| 3.2.7 几丁质结合测定方法 | 第54页 |
| 3.3 实验结果 | 第54-63页 |
| 3.3.1 OfChtI-CAD晶体生长、衍射数据收集和结构解析 | 第54-56页 |
| 3.3.2 OfChtI-CAD的整体结构分析 | 第56-57页 |
| 3.3.3 OfChtI-CAD的底物结合裂缝 | 第57-58页 |
| 3.3.4 OfChtI-CAD与其他GH18几丁质酶催化域的结构比较 | 第58-60页 |
| 3.3.5 Phe159、Phe194、Trp241和Tyr290对几丁质结合的作用 | 第60-63页 |
| 3.4 分析讨论 | 第63-65页 |
| 3.5 小结 | 第65-66页 |
| 4 OfChtI-CAD与寡糖底物结合的热力学和晶体学分析 | 第66-81页 |
| 4.1 引言 | 第66页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第66-69页 |
| 4.2.1 OfChtI-CAD突变体E148Q和E148A的克隆、表达与纯化 | 第66-67页 |
| 4.2.2 OfChtI-CAD及突变体与底物的复合物晶体的制备 | 第67-68页 |
| 4.2.3 X射线衍射数据收集和结构解析 | 第68页 |
| 4.2.4 等温量热滴定实验测定OfChtI-CAD对寡糖底物的结合能力 | 第68-69页 |
| 4.3 实验结果 | 第69-77页 |
| 4.3.1 寡糖底物与OfChtI-CAD结合的热力学分析 | 第69-72页 |
| 4.3.2 OfChtI-CAD与寡糖底物复合物晶体的结构分析 | 第72-77页 |
| 4.4 分析讨论 | 第77-79页 |
| 4.4.1 OfChtI-CAD的底物结合位点分析 | 第77-78页 |
| 4.4.2 OfChtI-CAD具有内切酶的性质 | 第78-79页 |
| 4.5 小结 | 第79-81页 |
| 5 寡聚葡萄糖胺作为18家族几丁质酶抑制剂的研究 | 第81-106页 |
| 5.1 引言 | 第81-82页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第82-85页 |
| 5.2.1 寡聚葡萄糖胺的来源 | 第82页 |
| 5.2.2 四种几丁质酶的克隆、表达与纯化 | 第82-84页 |
| 5.2.3 与寡聚葡萄糖胺结合相关的氨基酸残基的定点突变 | 第84页 |
| 5.2.4 寡聚葡萄糖胺对几丁质酶的抑制活性测定 | 第84页 |
| 5.2.5 等温量热滴定实验测定OfChtI与寡聚葡萄糖胺的结合能力 | 第84-85页 |
| 5.2.6 蛋白结晶和数据采集 | 第85页 |
| 5.2.7 寡聚葡萄糖胺抑制剂在昆虫体内的生物学评价 | 第85页 |
| 5.3 实验结果 | 第85-100页 |
| 5.3.1 四种几丁质酶的表达与纯化 | 第85-86页 |
| 5.3.2 寡聚葡萄糖胺对几丁质酶的抑制活性 | 第86-89页 |
| 5.3.3 寡聚葡萄糖胺对昆虫生长发育的影响 | 第89-90页 |
| 5.3.4 寡聚葡萄糖胺与OfChtI结合的热力学分析 | 第90-94页 |
| 5.3.5 寡聚葡萄糖胺与OfChtI-CAD的复合物晶体结构分析 | 第94-97页 |
| 5.3.6 催化氨基酸残基Glu148对抑制剂结合的作用 | 第97-98页 |
| 5.3.7 氨基酸残基Phe309和Trp372对底物和抑制剂结合的作用 | 第98-99页 |
| 5.3.8 OfChtI中-5结合位点的推测 | 第99-100页 |
| 5.4 分析讨论 | 第100-104页 |
| 5.4.1 寡聚葡萄糖胺结合模式的分析及抑制机理的提出 | 第100-102页 |
| 5.4.2 GlcN的乙酰化影响-2位点的结合亲和力 | 第102页 |
| 5.4.3 昆虫、人和细菌几丁质酶的结构差异 | 第102页 |
| 5.4.4 寡聚葡萄糖胺体内活性评价的分析 | 第102-104页 |
| 5.5 小结 | 第104-106页 |
| 6 结论与展望 | 第106-109页 |
| 6.1 本文的结论 | 第106-107页 |
| 6.2 创新点摘要 | 第107页 |
| 6.3 未来工作设想 | 第107-109页 |
| 参考文献 | 第109-118页 |
| 附录A (GlcNAc)_(3-6)的高效液相色谱分析谱图和质谱谱图 | 第118-119页 |
| 附录B (GlcN)_(2-7)的高效液相色谱分析谱图和质谱谱图 | 第119-122页 |
| 作者简介 | 第122页 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 | 第122-124页 |
| 致谢 | 第124页 |
