| 摘要 | 第9-13页 |
| ABSTRACT | 第13-17页 |
| 前言 | 第18-24页 |
| 第一章 报告基因和治疗基因的选择及质粒的提取鉴定 | 第24-47页 |
| 第一节 报告基因的选择和质粒的提取鉴定 | 第25-35页 |
| 1 试剂和仪器 | 第25页 |
| 1.1 试剂 | 第25页 |
| 1.2 仪器 | 第25页 |
| 2 实验方法 | 第25-32页 |
| 2.1 报告基因的选择依据 | 第25-26页 |
| 2.2 常用的报告基因 | 第26-28页 |
| 2.3 培养基的配制 | 第28页 |
| 2.4 质粒的转化 | 第28-29页 |
| 2.5 细菌的复苏、扩增和冻存 | 第29-30页 |
| 2.6 质粒DNA的大量抽提 | 第30-31页 |
| 2.7 质粒DNA浓度和纯度的测定 | 第31-32页 |
| 3 实验结果 | 第32-34页 |
| 3.1 质粒的抽提 | 第32-33页 |
| 3.2 质粒浓度和纯度的测定 | 第33-34页 |
| 4 讨论 | 第34-35页 |
| 第二节 治疗基因克隆和重组表达载体的构建及质粒的提取鉴定 | 第35-46页 |
| 1 试剂和仪器 | 第35-36页 |
| 1.1 试剂 | 第35页 |
| 1.2 仪器 | 第35-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-41页 |
| 2.1 基因载体的构建流程 | 第36页 |
| 2.2 载体的酶切 | 第36-37页 |
| 2.3 目的基因片段的获取 | 第37-38页 |
| 2.4 重组质粒的构建 | 第38-40页 |
| 2.5 阳性克隆的PCR鉴定 | 第40-41页 |
| 2.6 阳性克隆测序 | 第41页 |
| 2.7 阳性克隆的扩增和质粒的大量抽提 | 第41页 |
| 3 实验结果 | 第41-45页 |
| 3.1 载体酶切结果 | 第41页 |
| 3.2 目的基因PCR结果 | 第41-42页 |
| 3.3 重组质粒构建及PCR鉴定 | 第42-43页 |
| 3.4 阳性克隆测序结果及结果分析 | 第43-45页 |
| 3.5 质粒浓度和纯度的测定 | 第45页 |
| 4 讨论 | 第45-46页 |
| 小结 | 第46页 |
| 参考文献 | 第46-47页 |
| 第二章 PbAE的合成、表征及PbAE/DNA二元复合物的制备和体外评价 | 第47-79页 |
| 第一节 PbAE的合成及表征 | 第47-55页 |
| 1 试剂和仪器 | 第47-48页 |
| 1.1 试剂 | 第47页 |
| 1.2 仪器 | 第47-48页 |
| 2 实验方法 | 第48页 |
| 2.1 PbAE的合成 | 第48页 |
| 2.2 PbAE的表征 | 第48页 |
| 3 实验结果 | 第48-54页 |
| 3.1 PbAE的表观形状 | 第48-49页 |
| 3.2 PbAE的~1H-NMR和~(13)C-NMR图谱分析 | 第49-54页 |
| 3.3 凝胶渗透色谱分子量的测定 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 第二节 PbAE的筛选 | 第55-67页 |
| 1 试剂和仪器 | 第55-56页 |
| 1.1 试剂 | 第55页 |
| 1.2 仪器 | 第55-56页 |
| 2 试验方法 | 第56-58页 |
| 2.1 PbAE的体外细胞毒性 | 第56-57页 |
| 2.2 PbAE的血液相容性 | 第57页 |
| 2.3 琼脂糖凝胶电泳分析PbAE对DNA的压缩能力与聚合物结构的关系 | 第57-58页 |
| 2.4 细胞体外转染效率与聚合物结构的关系 | 第58页 |
| 3 实验结果 | 第58-66页 |
| 3.1 PbAE的体外细胞毒性 | 第58-62页 |
| 3.2 PbAE的血液相容性 | 第62-64页 |
| 3.3 PbAE对DNA的压缩能力与聚合物结构的关系 | 第64-65页 |
| 3.4 细胞体外转染效率与聚合物结构的关系 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| 第三节 PbAE/DNA二元复合物的制备及体外评价 | 第67-77页 |
| 1 试剂和仪器 | 第67-68页 |
| 1.1 试剂 | 第67-68页 |
| 1.2 仪器 | 第68页 |
| 2 实验方法 | 第68-70页 |
| 2.1 PbAE/DNA二元复合物的制备 | 第68-69页 |
| 2.2 PbAE/DNA二元复合物载体系统的体外性质考察 | 第69页 |
| 2.3 细胞培养 | 第69-70页 |
| 2.4 细胞毒性 | 第70页 |
| 2.5 细胞转染 | 第70页 |
| 3 实验结果 | 第70-76页 |
| 3.1 透射电镜观察复合物的形态 | 第70-71页 |
| 3.2 复合物的粒径和电位表征 | 第71-72页 |
| 3.3 凝胶电泳阻滞分析 | 第72-73页 |
| 3.4 复合物的细胞毒性 | 第73-74页 |
| 3.5 二元复合物作为pEGFP-N2递送载体的体外转染 | 第74-76页 |
| 4 讨论 | 第76-77页 |
| 本章小结 | 第77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 第三章 CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物的构建及体内外转染的研究 | 第79-130页 |
| 第一节 CM-PLH的合成及表征 | 第80-86页 |
| 1 试剂和仪器 | 第80页 |
| 2 试验方法 | 第80-82页 |
| 2.1 CM-PLH的合成 | 第80-81页 |
| 2.2 CM-PLH的1H-NMR表征 | 第81页 |
| 2.3 凝胶渗透色谱(GPC)测定CM-PLH的分子量 | 第81页 |
| 2.4 CM-PLH的酸碱滴定和浊度测定 | 第81页 |
| 2.5 溶血试验 | 第81-82页 |
| 3 实验结果 | 第82-84页 |
| 3.1 CM-PLH的1H-NMR表征和分子量测定 | 第82页 |
| 3.2 CM-PLH的酸碱滴定 | 第82-84页 |
| 3.3 溶血试验 | 第84页 |
| 4 讨论 | 第84-86页 |
| 第二节 CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物载体的制备及处方优化 | 第86-109页 |
| 1 试剂和仪器 | 第86页 |
| 2 试验方法 | 第86-89页 |
| 2.1 CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物的制备 | 第86-87页 |
| 2.2 CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物的表征 | 第87页 |
| 2.3 琼脂糖凝胶电泳阻滞分析 | 第87-88页 |
| 2.4 红细胞凝集试验 | 第88页 |
| 2.5 细胞培养 | 第88页 |
| 2.6 细胞毒性分析 | 第88页 |
| 2.7 细胞摄取 | 第88-89页 |
| 2.8 CM-PLH/PbAE/DNA介导绿色荧光蛋白报告基因的体外转染 | 第89页 |
| 3 实验结果 | 第89-105页 |
| 3.1 CM-PLH/PbAE/DNA复合物的制备及表征 | 第89-91页 |
| 3.2 凝胶电泳阻滞分析 | 第91-93页 |
| 3.3 红细胞凝集实验 | 第93-94页 |
| 3.4 复合物的细胞毒性 | 第94-95页 |
| 3.5 细胞摄取研究 | 第95-97页 |
| 3.6 三元复合物介导的pEGFP-N2体外转染的研究 | 第97-105页 |
| 4 讨论 | 第105-109页 |
| 第三节 三元复合物作为pTNFSF10-EGFP传递体系的体外研究 | 第109-121页 |
| 1 试剂和仪器 | 第109-110页 |
| 2 试验方法 | 第110-114页 |
| 2.1 CM-PLH/PbAE/pTNFSF10-EGFP三元复合物的制备 | 第110页 |
| 2.2 细胞及细胞培养 | 第110-111页 |
| 2.3 以GFP为指标衡量治疗基因的体外转染效率 | 第111页 |
| 2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 | 第111页 |
| 2.5 Western印迹分析TRAIL及凋亡相关蛋白的表达 | 第111-112页 |
| 2.6 细胞RNA抽提及定量PCR分析 | 第112-114页 |
| 3 实验结果 | 第114-120页 |
| 3.1 以EGFP为指标衡量治疗基因的体外转染效率 | 第114-115页 |
| 3.2 细胞凋亡 | 第115-117页 |
| 3.3 Western印迹分析TRAIL及凋亡相关蛋白的表达 | 第117-119页 |
| 3.4 定量PCR分析 | 第119-120页 |
| 4 讨论 | 第120-121页 |
| 第四节 三元复合物作为pGL3-promoter递送载体的体内研究 | 第121-127页 |
| 1 试剂和仪器 | 第121-122页 |
| 2 试验方法 | 第122-123页 |
| 2.1 CM-PLH/PbAE/pGL3-promoter三元复合物的制备 | 第122页 |
| 2.2 细胞及细胞培养 | 第122页 |
| 2.3 小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)皮下肿瘤模型 | 第122页 |
| 2.4 小鼠黑色素瘤(B16F10)细胞肺转移肿瘤模型的建立 | 第122页 |
| 2.5 给药方案 | 第122-123页 |
| 3 实验结果 | 第123-125页 |
| 3.1 皮下瘤和肺转移肿瘤模型的建立 | 第123页 |
| 3.2 体内转染分析 | 第123-125页 |
| 4 讨论 | 第125-127页 |
| 本章小结 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-130页 |
| 第四章 三元复合物的穿膜机理及胞内转运过程的研究 | 第130-152页 |
| 第一节 三元复合物载体系统细胞穿膜机理的研究 | 第130-139页 |
| 1 试剂和仪器 | 第130-131页 |
| 2 试验方法 | 第131-132页 |
| 2.1 CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物的制备 | 第131页 |
| 2.2. 细胞及细胞培养 | 第131页 |
| 2.3 内吞抑制剂对复合物内吞的影响 | 第131-132页 |
| 2.4 内吞抑制剂对复合物转染效率的影响 | 第132页 |
| 2.5 四甲基罗丹明(TRITC)标记转铁蛋白(Tf)的合成 | 第132页 |
| 2.6 YOYO-1标记质粒DNA | 第132页 |
| 2.7 复合物与内吞标记物TRITC-Tf和Alexa Fluor 555-CTB的共定位 | 第132页 |
| 3 试验结果 | 第132-137页 |
| 3.1 内吞抑制剂对细胞摄取复合物的影响 | 第133-135页 |
| 3.2 内吞抑制剂对转染效率的影响 | 第135-136页 |
| 3.3 复合物与内吞标记物的共定位 | 第136-137页 |
| 4 讨论 | 第137-139页 |
| 第二节 三元复合物载体系统的胞内转运过程的研究 | 第139-148页 |
| 1 试剂和仪器 | 第139-140页 |
| 2 试验方法 | 第140-141页 |
| 2.1 CM-PLH/PbAE/DNA三元复合物的制备 | 第140页 |
| 2.2 细胞及细胞培养 | 第140页 |
| 2.3 质粒DNA的荧光标记 | 第140页 |
| 2.4 抑制剂对复合物转染效率的研究 | 第140-141页 |
| 2.5 复合物与内酶体-溶酶体系统的共定位考察 | 第141页 |
| 3 试验结果 | 第141-146页 |
| 3.1 细胞骨架抑制剂对复合物转染效率的影响 | 第141-142页 |
| 3.2 内酶体-溶酶体系统酸化抑制剂对复合物转染效率的影响 | 第142页 |
| 3.3 动力蛋白抑制剂对转染效率的影响 | 第142-143页 |
| 3.4 复合物与内酶体-溶酶体系统的共定位 | 第143-146页 |
| 4 讨论 | 第146-148页 |
| 本章小结 | 第148页 |
| 参考文献 | 第148-152页 |
| 全文总结 | 第152-155页 |
| 在校期间所取得的成果 | 第155-158页 |
| 课题的创新性 | 第158-159页 |
| 综述 | 第159-173页 |
| 参考文献 | 第169-173页 |
| 致谢 | 第173-175页 |
