| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 英文缩写词 | 第7-12页 |
| 1 前言 | 第12-26页 |
| 1.1 H7N9的简介和研究现状 | 第12-17页 |
| 1.1.1 H7N9的简介 | 第12-15页 |
| 1.1.2 流感大流行和不断出现的流感感染人事件 | 第15-16页 |
| 1.1.3 流感病毒预防与治疗的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2 抗体结构和功能简介 | 第17-22页 |
| 1.2.1 抗体的结构 | 第17-18页 |
| 1.2.2 抗体功能介绍 | 第18页 |
| 1.2.3 抗体基因的多样性 | 第18-20页 |
| 1.2.3.1 抗体多样性的遗传学说 | 第18-19页 |
| 1.2.3.2 V（D）J重组 | 第19页 |
| 1.2.3.3 高频突变与亲和力成熟 | 第19-20页 |
| 1.2.4 抗体的种类 | 第20-22页 |
| 1.2.4.1 多克隆抗体 | 第20页 |
| 1.2.4.2 单克隆抗体 | 第20-22页 |
| 1.3 抗体筛选的技术 | 第22-26页 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术的简介 | 第22-23页 |
| 1.3.2 酵母展示技术筛选抗体 | 第23页 |
| 1.3.3 B细胞永生化 | 第23-24页 |
| 1.3.4 单细胞PCR技术 | 第24-26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-48页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1 分子克隆相关材料 | 第26页 |
| 2.1.2 细胞培养和质粒转染相关试剂 | 第26页 |
| 2.1.3 流感病毒 | 第26页 |
| 2.1.4 SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色 | 第26页 |
| 2.1.5 ELISA | 第26-27页 |
| 2.1.6 病毒微量中和实验 | 第27页 |
| 2.1.7 血凝抑制实验（HI） | 第27页 |
| 2.1.8 Western blot实验材料 | 第27页 |
| 2.1.9 BCA蛋白定量实验 | 第27页 |
| 2.1.10 涉及的分析网站和分析软件 | 第27-28页 |
| 2.2 实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-48页 |
| 2.3.1 猕猴免疫 | 第30页 |
| 2.3.2 猕猴PBMC分离 | 第30页 |
| 2.3.3 猕猴PBMC抗体染色和流式分选 | 第30-31页 |
| 2.3.4 单细胞PCR扩增 | 第31-33页 |
| 2.3.5 一步法无缝克隆抗体基因 | 第33-39页 |
| 2.3.5.1 抗体基因p CI-neo-Ig G1, p CI-neo-K/L线性载体制备 | 第35页 |
| 2.3.5.2 线性化载体去甲基化 | 第35页 |
| 2.3.5.3 线性化载体纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.5.4 抗体基因连接到对应载体上 | 第36页 |
| 2.3.5.5 连接产物转化 | 第36-37页 |
| 2.3.5.6 挑取单克隆细菌和菌液PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.5.7 阳性克隆送测序 | 第38页 |
| 2.3.5.8 测序结果分析 | 第38页 |
| 2.3.5.9 测序正确的菌液扩大培养并提取质粒 | 第38-39页 |
| 2.3.6 抗体基因在 293T细胞中的表达 | 第39-40页 |
| 2.3.7 SDS-PAGE及考马斯亮蓝检测抗体表达 | 第40-41页 |
| 2.3.7.1 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第40页 |
| 2.3.7.2 SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色 | 第40-41页 |
| 2.3.8 抗体凝缩和纯化 | 第41-42页 |
| 2.3.8.1 细胞抗体上清离心超滤浓缩 | 第41页 |
| 2.3.8.2 浓缩后抗体纯化实验 | 第41-42页 |
| 2.3.8.3 SDS-PAGE胶鉴定纯化产物 | 第42页 |
| 2.3.8.4 BCA法测定纯化产物浓度 | 第42页 |
| 2.3.9 抗体与H7N9的HA蛋白结合能力检测 | 第42-43页 |
| 2.3.10 生物膜层干涉技术（BLI）检测抗原抗体亲和力 | 第43-44页 |
| 2.3.11 Western Blot方法检测抗体结合HA蛋白表位 | 第44-45页 |
| 2.3.12 荧光病毒微量中和实验检测抗体中和滴度 | 第45-46页 |
| 2.3.13 血凝抑制实验 | 第46-48页 |
| 2.3.13.1 8单位抗原制备 | 第46页 |
| 2.3.13.2 HI实验 | 第46-48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-61页 |
| 3.1 猕猴免疫灭活H7N9流感疫苗的抗体反应 | 第48-49页 |
| 3.2 流式分选单个猕猴浆母细胞 | 第49页 |
| 3.3 单细胞PCR获得H7N9抗体基因 | 第49-50页 |
| 3.4 H7N9抗体基因克隆和表达载体构建 | 第50-52页 |
| 3.4.1 H7N9抗体基因扩增 | 第50-51页 |
| 3.4.2 抗体基因与载体连接后鉴定 | 第51-52页 |
| 3.4.3 2G11基因的序列分析 | 第52页 |
| 3.5 H7N9抗体表达、鉴定和纯化 | 第52-54页 |
| 3.5.1 SDS-PAGE检测抗体的表达 | 第52-53页 |
| 3.5.2 2G11抗体纯化 | 第53-54页 |
| 3.6 H7N9抗体活性分析 | 第54-58页 |
| 3.6.1 ELISA检测 2G11与H7N9-HA结合能力 | 第54-56页 |
| 3.6.2 Western blot分析抗原抗体结合表位 | 第56-57页 |
| 3.6.3 生物膜层干涉技术检测抗原抗体亲和力 | 第57-58页 |
| 3.7 病毒微量中和实验检测抗体中和活性 | 第58-59页 |
| 3.8 HI血凝抑制检测抗体中和滴度 | 第59-61页 |
| 4 讨论与结论 | 第61-63页 |
| 4.1 讨论 | 第61-62页 |
| 4.1.1 分离浆母细胞筛选抗体是有效分离高亲和力抗体的方法 | 第61页 |
| 4.1.2 猕猴浆母细胞抗体筛选难度大 | 第61-62页 |
| 4.1.3 单细胞PCR筛选抗体的技术可靠性 | 第62页 |
| 4.2 结论 | 第62-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-71页 |
| 附录 | 第71-81页 |
