| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 中英文缩写对照表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-33页 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.1.1 枯草芽孢杆菌简介 | 第14页 |
| 1.1.2 枯草芽孢杆菌表达体系的优缺点 | 第14-15页 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌表达宿主与质粒载体 | 第15-18页 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌宿主介绍 | 第15-16页 |
| 1.2.2 枯草芽孢杆菌中载体介绍 | 第16-18页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌转录、翻译及外分泌系统介绍 | 第18-26页 |
| 1.3.1 枯草芽孢杆菌转录系统介绍 | 第18-19页 |
| 1.3.2 枯草芽孢杆菌翻译系统介绍 | 第19-20页 |
| 1.3.3 枯草芽孢杆菌分泌体系介绍 | 第20-25页 |
| 1.3.4 枯草芽孢杆菌分泌表达瓶颈 | 第25-26页 |
| 1.4 脂肪酶介绍 | 第26-31页 |
| 1.4.1 脂肪酶的定义与反应特性 | 第26页 |
| 1.4.2 脂肪酶的来源与分类 | 第26-28页 |
| 1.4.3 脂肪酶的应用 | 第28-29页 |
| 1.4.4 耐溶剂脂肪酶介绍 | 第29-30页 |
| 1.4.5 模式脂肪酶LipS介绍 | 第30-31页 |
| 1.5 本课题的研究思路与主要内容 | 第31-33页 |
| 第二章 脂肪酶LipS在枯草杆菌中合适信号肽的筛选与优化 | 第33-58页 |
| 2.1 引言 | 第33-34页 |
| 2.2 材料和方法 | 第34-39页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第34页 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 | 第34-37页 |
| 2.2.3 PCR使用引物 | 第37-38页 |
| 2.2.4 实验中使用的培养基配制 | 第38-39页 |
| 2.2.5 主要仪器和设备 | 第39页 |
| 2.3 实验与分析方法 | 第39-45页 |
| 2.3.1 基因和质粒操作 | 第39-43页 |
| 2.3.2 大肠杆菌E coli DH5a感受态细胞的制备与转化验证 | 第43页 |
| 2.3.3 枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化 | 第43-44页 |
| 2.3.4 重组工程菌的发酵表达 | 第44页 |
| 2.3.5 脂肪酶酶活力的检测 | 第44-45页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测 | 第45页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第45-56页 |
| 2.4.1 枯草芽孢杆菌基因组DNA提取 | 第45-46页 |
| 2.4.2 带有phoD信号肽表达载体pMAphoDL的构建 | 第46-47页 |
| 2.4.3 带有其它信号肽表达载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.4.4 含不同信号肽重组菌发酵液酶活曲线的测定 | 第48-49页 |
| 2.4.5 含不同信号肽重组菌分泌效率的分析 | 第49-51页 |
| 2.4.6 重组菌表达产物SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳分析 | 第51-52页 |
| 2.4.7 含NprB信号肽突变型载体的构建 | 第52-53页 |
| 2.4.8 含NprB信号肽突变体重组菌的表达 | 第53-54页 |
| 2.4.9 含phoD信号肽突变型载体的构建 | 第54-55页 |
| 2.4.10 含phoD信号肽突变体重组菌的发酵表达 | 第55-56页 |
| 2.5 小结 | 第56-58页 |
| 第三章 表达载体元件的替换和改造对脂肪酶表达量的影响 | 第58-79页 |
| 3.1 引言 | 第58-59页 |
| 3.2 材料和方法 | 第59-60页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第59页 |
| 3.2.2 PCR使用引物 | 第59-60页 |
| 3.2.3 实验药品与试剂 | 第60页 |
| 3.2.4 培养基及培养条件 | 第60页 |
| 3.2.5 主要仪器和设备 | 第60页 |
| 3.3 实验与分析方法 | 第60-65页 |
| 3.3.1 基因和质粒操作 | 第60-61页 |
| 3.3.2 表达载体pMP43phoDDFRL的构建 | 第61页 |
| 3.3.3 表达载体pMPsacBphoDDFRL的构建 | 第61-62页 |
| 3.3.4 表达载体pHBphoDDFRL的构建 | 第62-63页 |
| 3.3.5 表达载体pHBP43phoDDFRL的构建 | 第63-64页 |
| 3.3.6 mRNA二级结构的分析 | 第64-65页 |
| 3.3.7 重组载体pHBphoDDFRL的突变 | 第65页 |
| 3.3.8 脂肪酶活力检测 | 第65页 |
| 3.3.9 重组菌表达产物SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测 | 第65页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第65-78页 |
| 3.4.1 组成型分泌表达载体pMP43phoDDFRL的构建 | 第65-66页 |
| 3.4.2 诱导型分泌表达载体pMPsacBphoDDFRL的构建 | 第66-67页 |
| 3.4.3 诱导型分泌表达载体pHBphoDDFRL的构建 | 第67-68页 |
| 3.4.4 双启动子分泌表达载体pHBP43phoDDFRL的构建 | 第68页 |
| 3.4.5 含不同启动子重组菌生长曲线的测定 | 第68-70页 |
| 3.4.6 含不同启动子重组菌株发酵液酶活曲线的测定 | 第70-72页 |
| 3.4.7 各重组菌发酵液SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测 | 第72-73页 |
| 3.4.8 转录产物mRNA结构的改造 | 第73-76页 |
| 3.4.9 含不同mRNA结构突变体重组菌的表达评估 | 第76-78页 |
| 3.5 小结 | 第78-79页 |
| 第四章 重组菌诱导表达条件优化及质粒稳定性分析 | 第79-87页 |
| 4.1 引言 | 第79页 |
| 4.2 材料和方法 | 第79页 |
| 4.2.1 菌种 | 第79页 |
| 4.2.2 实验药品与仪器 | 第79页 |
| 4.2.3 培养基及培养条件 | 第79页 |
| 4.3 实验与分析方法 | 第79-80页 |
| 4.3.1 重组菌WB800N(pHBRCphoDDFRL)培养表达条件优化 | 第79页 |
| 4.3.2 脂肪酶转酯化活力检测及发酵液SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳分析 | 第79-80页 |
| 4.3.3 重组质粒pHBRCphoDDFRL稳定性测定 | 第80页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第80-86页 |
| 4.4.1 诱导剂IPTG浓度对重组菌WB800N(pHBRCphoDDFRL)分泌表达的影响 | 第80-81页 |
| 4.4.2 诱导时机对重组菌WB800N(pHBRCphoDDFRL)分泌表达的影响 | 第81页 |
| 4.4.3 诱导温度对重组菌WB800N(pHBRCphoDDFRL)分泌表达的影响 | 第81-82页 |
| 4.4.4 诱导时间对重组菌WB800N(pHBRCphoDDFRL)分泌表达的影响 | 第82-83页 |
| 4.4.5 优化前后发酵液SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳检测 | 第83-84页 |
| 4.4.6 重组质粒pHBRCphoDDFRL分离稳定性测定 | 第84页 |
| 4.4.7 重组质粒pHBRCphoDDFRL结构稳定性测定 | 第84-86页 |
| 4.5 小结 | 第86-87页 |
| 第五章 总结与展望 | 第87-90页 |
| 5.1 全文总结 | 第87-88页 |
| 5.2 论文创新点 | 第88页 |
| 5.3 工作展望 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-98页 |
| 作者简历 | 第98-99页 |
| 附录 | 第99-100页 |
| 附录Ⅰ 脂肪酶基因序列 | 第99-100页 |
| 附录Ⅱ 各信号肽基因序列 | 第100页 |
