| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略表 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-34页 |
| 1.1 冠状病毒概述 | 第15-16页 |
| 1.2 猪流行性腹泻与猪流行性腹泻病毒 | 第16-19页 |
| 1.2.1 猪流行性腹泻 | 第16-18页 |
| 1.2.2 猪流行性腹泻病毒 | 第18-19页 |
| 1.3 猪流行性腹泻病毒的分子特征 | 第19-24页 |
| 1.3.1 5'非编码区和3'非编码区(5'UTR,3'UTR) | 第20-21页 |
| 1.3.2 复制酶基因及其产物 | 第21页 |
| 1.3.3 结构基因及其产物 | 第21-24页 |
| 1.4 冠状病毒与宿主细胞蛋白的相互作用 | 第24-25页 |
| 1.4.1 结构蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用 | 第24-25页 |
| 1.4.2 非结构蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用 | 第25页 |
| 1.5 NPM1蛋白 | 第25-27页 |
| 1.5.1 NPM1基因结构 | 第25-26页 |
| 1.5.2 NPM1蛋白结构域 | 第26页 |
| 1.5.3 NPM1蛋白细胞定位 | 第26页 |
| 1.5.4 NPM1蛋白在体内的作用 | 第26页 |
| 1.5.5 NPM1蛋白的转录后修饰 | 第26-27页 |
| 1.6 EB3蛋白 | 第27-28页 |
| 1.7 HSP47蛋白 | 第28-29页 |
| 1.8 蛋白相互作用的研究方法 | 第29-32页 |
| 1.8.1 免疫共沉淀技术 | 第29-30页 |
| 1.8.2 酵母双杂交技术 | 第30页 |
| 1.8.3 哺乳动物双杂交技术 | 第30-31页 |
| 1.8.4 细菌双杂交技术 | 第31页 |
| 1.8.5 计算机预测蛋白质-蛋白质相互作用 | 第31-32页 |
| 1.8.6 GST-pull down技术 | 第32页 |
| 1.9 本研究的目的与意义 | 第32-34页 |
| 第二章 核仁定位相关蛋白NPM1在PEDV复制中的作用 | 第34-61页 |
| 2.1 材料和方法 | 第36-44页 |
| 2.1.1 毒株、细胞、载体、抗体、生化试剂以及主要仪器设备 | 第36-37页 |
| 2.1.2 主要溶液及试剂的配制 | 第37页 |
| 2.1.3 RNA的提取 | 第37页 |
| 2.1.4 RNA反转录 | 第37-38页 |
| 2.1.5 基因扩增 | 第38-39页 |
| 2.1.6 重组质粒的构建及大量制备 | 第39-40页 |
| 2.1.7 原核表达及蛋白的纯化 | 第40-41页 |
| 2.1.8 细胞转染 | 第41页 |
| 2.1.9 免疫共沉淀 | 第41-42页 |
| 2.1.10 GST-pull down试验 | 第42页 |
| 2.1.11 Western blot检测 | 第42页 |
| 2.1.12 激光共聚焦试验 | 第42页 |
| 2.1.13 SiRNA干扰 | 第42-43页 |
| 2.1.14 蛋白过表达或SiRNA干扰对病毒复制影响 | 第43页 |
| 2.1.15 PEDV滴度的测定 | 第43-44页 |
| 2.1.16 DNA凋亡片段的提取 | 第44页 |
| 2.1.17 数据分析 | 第44页 |
| 2.2 结果 | 第44-58页 |
| 2.2.1 核质分离证明PEDVN蛋白存在于细胞核中 | 第44-45页 |
| 2.2.2 免疫共沉淀验证N蛋白与NPM1蛋白存在相互作用 | 第45-48页 |
| 2.2.3 GST-pull down试验验证N蛋白与NPM1蛋白存在相互作用 | 第48页 |
| 2.2.4 激光共聚焦显微镜验证N蛋白和NPM1蛋白具有共定位现象 | 第48页 |
| 2.2.5 N蛋白与NPM1蛋白相互作用必须区域的鉴定 | 第48-51页 |
| 2.2.6 N蛋白的核仁定位是一个主动过程 | 第51页 |
| 2.2.7 NPM1蛋白K263R增强NPM1蛋白和N蛋白之间的相互作用 | 第51-53页 |
| 2.2.8 PEDV感染上调NPM1蛋白的表达 | 第53-54页 |
| 2.2.9 过表达NPM1蛋白促进PEDV的增殖和N蛋白的表达 | 第54-55页 |
| 2.2.10 SiRNA下调NPM1蛋白表达抑制PEDV的增殖和N蛋白的表达 | 第55-56页 |
| 2.2.11 N蛋白和NPM1蛋白相互作用,防止蛋白酶对NPM1蛋白的切割作用从而增强细胞的生存能力 | 第56-58页 |
| 2.3 讨论 | 第58-61页 |
| 第三章 与PEDV相互作用宿主蛋白的筛选及鉴定 | 第61-77页 |
| 3.1 材料和方法 | 第62-69页 |
| 3.1.1 病毒、细胞、质粒、和菌株 | 第62页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第62页 |
| 3.1.3 Vero E6细胞酵母cDNA文库的构建 | 第62-66页 |
| 3.1.4 细胞及病毒RNA的提取 | 第66页 |
| 3.1.5 RNA反转录 | 第66页 |
| 3.1.6 本研究所用引物及基因扩增 | 第66页 |
| 3.1.7 基因的扩增与克隆 | 第66-67页 |
| 3.1.8 pGBK-M诱饵质粒的毒性和自激活检测 | 第67页 |
| 3.1.9 酵母双杂交筛选与M蛋白相互作用的宿主蛋白 | 第67页 |
| 3.1.10 酵母质粒的提取 | 第67-68页 |
| 3.1.11 阳性PCR鉴定及测序分析 | 第68页 |
| 3.1.12 共转化验证 | 第68页 |
| 3.1.13 细胞转染 | 第68页 |
| 3.1.14 免疫共沉淀和GST-pull down试验 | 第68页 |
| 3.1.15 激光共聚焦 | 第68-69页 |
| 3.1.16 细胞的处理及PEDV滴度的测定 | 第69页 |
| 3.2 结果 | 第69-75页 |
| 3.2.1 文库质量的评价 | 第69页 |
| 3.2.2 M蛋白与EB3存在相互作用 | 第69页 |
| 3.2.3 PEDV感染上调EB3蛋白的表达,过表达EB3蛋白促进PEDV的增殖和M蛋白的表达 | 第69-72页 |
| 3.2.4 NSP7蛋白与HSP47存在相互作用 | 第72页 |
| 3.2.5 PEDV感染下调HSP47蛋白的表达,过表达HSP47蛋白抑制PEDV的增殖和N蛋白的表达 | 第72-75页 |
| 3.3 讨论 | 第75-77页 |
| 第四章 全文结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 作者简历 | 第96页 |
