| 中文摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 前言 | 第16-28页 |
| 1. 乙型肝炎病毒相关肝纤维化的研究现状 | 第16-20页 |
| 1.1 乙型肝炎病毒及肝纤维化 | 第16页 |
| 1.2 肝纤维化的机制 | 第16-20页 |
| 1.2.1 星状细胞与肝纤维化 | 第17-18页 |
| 1.2.2 细胞因子、信号通路与肝纤维化 | 第18-20页 |
| 2. 蛋白质组学在肝脏疾病中的应用 | 第20-22页 |
| 2.1 蛋白质组学在肝炎研究中的进展 | 第20-21页 |
| 2.2 蛋白质组学在肝纤维化和肝硬化研究中的进展 | 第21-22页 |
| 3. 转录组学在肝脏疾病中的应用 | 第22-24页 |
| 4. 肝纤维化动物模型 | 第24-25页 |
| 5. 本研究的目的与意义 | 第25页 |
| 5.1 本研究的目的 | 第25页 |
| 5.2 本研究的意义 | 第25页 |
| 6. 本研究的技术路线 | 第25-28页 |
| 第一部分 HBV持续性复制并伴有肝纤维化的小鼠模型的建立 | 第28-54页 |
| 1. 实验材料 | 第28-33页 |
| 1.1 供试材料 | 第28页 |
| 1.2 供试菌种及质粒 | 第28页 |
| 1.3 扩增引物 | 第28-29页 |
| 1.4 主要的分子生物学及生化试剂 | 第29-30页 |
| 1.4.1 生化试剂 | 第29页 |
| 1.4.2 细胞培养试剂及试剂盒 | 第29-30页 |
| 1.5 主要缓冲液及试剂配制 | 第30-31页 |
| 1.5.1 主要缓冲液 | 第30页 |
| 1.5.2 培养基配制 | 第30页 |
| 1.5.3 免疫组化试剂 | 第30-31页 |
| 1.6 主要仪器设备及耗材 | 第31-33页 |
| 1.6.1 主要仪器设备 | 第31-32页 |
| 1.6.2 主要耗材 | 第32-33页 |
| 2. 实验方法 | 第33-44页 |
| 2.1 AAV8-1.2HBV重组病毒的制备及纯化 | 第33-34页 |
| 2.1.1 AAV8-1.2HBV重组病毒的制备 | 第33页 |
| 2.1.2 AAV8-1.2HBV重组病毒的纯化 | 第33-34页 |
| 2.2 AAV8-1.2HBV重组病毒的定量 | 第34-36页 |
| 2.2.1 AAV8-1.2HBV重组病毒基因组DNA提取 | 第34-35页 |
| 2.2.2 AAV8-1.2HBV重组病毒的定量 | 第35-36页 |
| 2.3 HBV持续性复制并伴有肝纤维化的小鼠模型的建立 | 第36-41页 |
| 2.3.1 AAV8-1.2HBV重组病毒尾静脉注射C57BL/6小鼠 | 第36页 |
| 2.3.2 血液样本的采集 | 第36页 |
| 2.3.3 肝脏组织样本的采集 | 第36-37页 |
| 2.3.4 小鼠血清和组织样本中DNA提取及HBV DNA的定量 | 第37页 |
| 2.3.5 血清中ALT和AST的检测 | 第37页 |
| 2.3.6 血清中TGF-β1和TIMP-1测定 | 第37-38页 |
| 2.3.7 肝脏组织中羟脯氨酸含量测定 | 第38页 |
| 2.3.8 小鼠肝脏组织总RNA的提取 | 第38-39页 |
| 2.3.9 cDNA第一链的合成 | 第39-40页 |
| 2.3.10 肝纤维化指标的RT-qPCR分析 | 第40-41页 |
| 2.4 小鼠肝脏组织的病理学分析 | 第41-44页 |
| 2.4.1 小鼠肝组织的Masson染色分析 | 第41页 |
| 2.4.2 小鼠肝组织的Sirius Red染色分析 | 第41页 |
| 2.4.3 小鼠肝组织的HE染色分析 | 第41-42页 |
| 2.4.4 HBsAg的免疫组化分析 | 第42-43页 |
| 2.4.5 HBcAg的免疫组化分析 | 第43-44页 |
| 3. 结果与分析 | 第44-52页 |
| 3.1 AAV8可以介导HBV基因组在小鼠体内长期复制 | 第44-45页 |
| 3.2 AAV8能有效介导HBV基因在小鼠体内长期表达 | 第45-46页 |
| 3.3 AAV8-1.2HBV重组病毒注射不引起急性炎症反应 | 第46-48页 |
| 3.4 AAV8-1.2HBV重组病毒注射诱导小鼠形成肝纤维化 | 第48-52页 |
| 3.4.1 AAV8-1.2HBV重组病毒注射诱导肝纤维化标志物上调表达 | 第48-50页 |
| 3.4.2 AAV8-1.2HBV重组病毒注射诱导小鼠形成肝纤维化 | 第50-52页 |
| 4. 讨论 | 第52-54页 |
| 第二部分 HBV相关肝纤维化模型小鼠肝脏组织的蛋白质组学研究 | 第54-75页 |
| 1. 实验材料 | 第54-57页 |
| 1.1 研究对象与分组 | 第54页 |
| 1.2 主要试剂 | 第54-55页 |
| 1.3 主要试剂盒 | 第55页 |
| 1.4 主要试剂的配制 | 第55-57页 |
| 2. 实验方法 | 第57-64页 |
| 2.1 肝脏组织总蛋白的提取 | 第57页 |
| 2.2 样本中蛋白质浓度的测定 | 第57-58页 |
| 2.3 二维凝胶电泳(2-DE)分析 | 第58-59页 |
| 2.4 2DE凝胶的银染 | 第59-60页 |
| 2.5 凝胶扫描与分析 | 第60页 |
| 2.6 蛋白质点的原位酶解 | 第60-61页 |
| 2.6.1 差异蛋白点的采集及脱色 | 第60页 |
| 2.6.2 差异蛋白质的还原与烷基化 | 第60-61页 |
| 2.6.3 差异蛋白质的胶内酶切与萃取 | 第61页 |
| 2.7 MALDI-TOF/TOF肽质量指纹图谱分析 | 第61-62页 |
| 2.7.1 基质的制备 | 第61页 |
| 2.7.2 样品盘的清洗 | 第61页 |
| 2.7.3 样品的制备 | 第61-62页 |
| 2.7.4 MALDI-TOF/TOF质谱分析 | 第62页 |
| 2.8 蛋白质鉴定数据库搜寻 | 第62页 |
| 2.9 生物信息学分析 | 第62-64页 |
| 3. 结果与分析 | 第64-72页 |
| 3.1 肝脏组织的二维凝胶电泳分析 | 第64-66页 |
| 3.2 差异蛋白点的PMF MS/MS检索与分析 | 第66-67页 |
| 3.3 生物信息学分析 | 第67-72页 |
| 3.3.1 GO富集分析 | 第67-68页 |
| 3.3.2 KEGG Pathway富集分析 | 第68-69页 |
| 3.3.3 蛋白与蛋白相互作用网络分析 | 第69-72页 |
| 4. 讨论 | 第72-75页 |
| 第三部分 HBV相关肝纤维化模型小鼠肝脏组织的转录组学研究 | 第75-99页 |
| 1. 实验材料 | 第75-76页 |
| 1.1 研究对象与分组 | 第75页 |
| 1.2 主要试剂盒 | 第75-76页 |
| 2. 实验方法 | 第76-82页 |
| 2.1 RNA测序样本准备 | 第76-80页 |
| 2.1.1 RNA的提取 | 第76页 |
| 2.1.2 RNA质量评估 | 第76页 |
| 2.1.3 mRNA的纯化 | 第76-77页 |
| 2.1.4 mRNA的片段化 | 第77页 |
| 2.1.5 cDNA第一链的合成 | 第77-78页 |
| 2.1.6 cDNA第二链的合成 | 第78页 |
| 2.1.7 cDNA末端修复 | 第78页 |
| 2.1.8 DNA片段的3'末端加'A' | 第78-79页 |
| 2.1.9 DNA片段与接头连接 | 第79页 |
| 2.1.10 纯化cDNA模板 | 第79页 |
| 2.1.11 PCR富集纯化的cDNA模板 | 第79-80页 |
| 2.1.12 文库的检验 | 第80页 |
| 2.2 RNA测序 | 第80页 |
| 2.3 RNA测序结果分析 | 第80-82页 |
| 2.3.1 原始数据的处理 | 第80页 |
| 2.3.2 基因表达量计算 | 第80-81页 |
| 2.3.3 差异基因的生物信息学分析 | 第81-82页 |
| 3. 结果与分析 | 第82-96页 |
| 3.1 肝脏组织中RNA纯度和完整性的鉴定结果 | 第82-83页 |
| 3.2 测序结果与参考序列的比对分析 | 第83-84页 |
| 3.3 差异转录基因的筛选 | 第84-86页 |
| 3.4 差异基因的GO富集分析 | 第86-88页 |
| 3.5 KEGG Pathway富集分析 | 第88-90页 |
| 3.6 蛋白与蛋白相互作用网络分析 | 第90-96页 |
| 4. 讨论 | 第96-99页 |
| 第四部分 肝纤维化机制分析 | 第99-121页 |
| 1. 实验材料 | 第99-100页 |
| 1.1 研究对象 | 第99页 |
| 1.2 主要试剂与试剂盒 | 第99-100页 |
| 2. 实验方法 | 第100-103页 |
| 2.1 生物信息学分析 | 第100页 |
| 2.2 差异蛋白和差异基因的验证 | 第100-101页 |
| 2.2.1 RT-qPCR验证 | 第100页 |
| 2.2.2 Western Blot验证 | 第100-101页 |
| 2.3 LX2细胞的复苏和传代 | 第101页 |
| 2.4 siRNA转染 | 第101-102页 |
| 2.5 TGFβ1表达水平的RT-qPCR分析 | 第102-103页 |
| 3. 结果与分析 | 第103-117页 |
| 3.1 蛋白质组学和转录组学结果的匹配分析 | 第103-105页 |
| 3.2 重叠蛋白的生物信息学分析 | 第105-110页 |
| 3.2.1 DAVID功能富集分析 | 第105-109页 |
| 3.2.2 蛋白与蛋白相互作用网络分析 | 第109-110页 |
| 3.3 重叠蛋白的验证 | 第110-117页 |
| 3.3.1 重叠蛋白的RT-qPCR和Western Blot验证 | 第110-113页 |
| 3.3.2 差异基因在LX2细胞系中的验证 | 第113-115页 |
| 3.3.3 LX2细胞中Nlrp1基因的初步研究 | 第115-117页 |
| 4. 讨论 | 第117-121页 |
| 结论 | 第121-122页 |
| 参考文献 | 第122-136页 |
| 博士期间发表文章情况 | 第136-137页 |
| 附录 | 第137-164页 |
| 致谢 | 第164页 |
