| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第11-29页 |
| 1.1 古菌概述 | 第11-12页 |
| 1.1.1 古菌的发现及分类 | 第11页 |
| 1.1.2 古菌的特征 | 第11-12页 |
| 1.1.3 研究古菌的目的和意义 | 第12页 |
| 1.2 硫化叶菌 | 第12-16页 |
| 1.2.1 硫化叶菌概述 | 第12-13页 |
| 1.2.2 硫化叶菌的遗传表达系统 | 第13-16页 |
| 1.3 古菌中蛋白磷酸化修饰及激酶 | 第16-27页 |
| 1.3.1 生物中的蛋白翻译后修饰概述 | 第16-18页 |
| 1.3.2 古菌中的蛋白磷酸化修饰及激酶 | 第18-27页 |
| 1.4 本文研究的目的和意义 | 第27-29页 |
| 第二章 SiRe_2056体外生化性质分析 | 第29-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第29页 |
| 2.1.1 菌株及培养基 | 第29页 |
| 2.1.2 材料 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-33页 |
| 2.2.1 野生型及突变体pET22b系列载体和pSeSD载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.2 野生型激酶结构域蛋白在大肠杆菌中的表达纯化,分子筛纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.3 激酶试剂盒实验 | 第31-32页 |
| 2.2.4 突变体蛋白在大肠杆菌中的表达纯化 | 第32页 |
| 2.2.5 突变体蛋白PKC-T525A-C-His在冰岛硫化叶菌中的表达纯化 | 第32-33页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第33-41页 |
| 2.3.1 野生型及突变体pET22b系列载体和pSeSD载体的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.2 激酶结构域在大肠杆菌中的表达 | 第34-35页 |
| 2.3.3 野生型激酶结构域蛋白的激酶活性分析 | 第35-38页 |
| 2.3.4 定点突变体蛋白在大肠杆菌中的表达纯化 | 第38-40页 |
| 2.3.5 [γ-~(32)p]ATP实验分析关键性位点的作用 | 第40-41页 |
| 2.4 总结与讨论 | 第41-43页 |
| 第三章 SiRe_2056的基因的必需性分析 | 第43-55页 |
| 3.1 实验材料 | 第43页 |
| 3.1.1 菌株及培养基 | 第43页 |
| 3.2 实验方法 | 第43-46页 |
| 3.2.1 敲除质粒pK-2056构建 | 第43-44页 |
| 3.2.2 敲除载体pK-2056的线性化处理 | 第44页 |
| 3.2.3 冰岛硫化叶菌E233S细胞的电转化 | 第44页 |
| 3.2.4 整合型菌株的筛选 | 第44-45页 |
| 3.2.5 突变体增值实验 | 第45页 |
| 3.2.6 敲除型菌株的筛选 | 第45页 |
| 3.2.7 DNA损伤剂敏感性实验 | 第45-46页 |
| 3.3 实验结果及讨论 | 第46-54页 |
| 3.3.1 敲除质粒pK-2056构建 | 第46-47页 |
| 3.3.2 整合型菌株的筛选 | 第47-49页 |
| 3.3.3 突变体增殖实验 | 第49-51页 |
| 3.3.4 敲除型菌株的筛选 | 第51-54页 |
| 3.4 小结和讨论 | 第54-55页 |
| 第四章 SiRe_2056的体内过表达与菌株的表型分析 | 第55-75页 |
| 4.1 实验材料 | 第55页 |
| 4.1.1 菌株及培养基 | 第55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.2.1 野生型及突变体pSeSD系列载体的构建 | 第55-56页 |
| 4.2.2 野生型和突变体pSeSD质粒的电转和单克隆的筛选 | 第56页 |
| 4.2.3 冰岛硫化叶菌中野生型和突变体菌株生长曲线测定及细胞形态观察 | 第56-57页 |
| 4.2.4 Western blot确认野生型和突变体目的蛋白的表达 | 第57页 |
| 4.2.5 古菌中PKC-C-his的pull-down实验及质谱分析 | 第57-58页 |
| 4.2.6 p-Thr抗体检测底物 | 第58页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第58-73页 |
| 4.3.1 pSeSD系列载体的构建 | 第58-59页 |
| 4.3.2 Western blot检测野生型和突变体蛋白的表达量 | 第59-62页 |
| 4.3.3 野生型和突变体过表达生长曲线的测定 | 第62-67页 |
| 4.3.4 过表达菌株的细胞形态观察 | 第67-70页 |
| 4.3.5 pull-down实验及质谱分析 | 第70-71页 |
| 4.3.6 p-Thr抗体检测底物 | 第71-73页 |
| 4.4 总结与讨论 | 第73-75页 |
| 第五章 总结与展望 | 第75-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 附录 | 第83-91页 |
| 附录一 药品和试剂 | 第83-84页 |
| 附录二 本文所用的PCR引物、构建的质粒和菌株 | 第84-87页 |
| 附录三 本论文中所用培养基 | 第87-89页 |
| 附录四 S. islandicus Rey15A_(E233S)感受态细胞制备、电转化 | 第89-90页 |
| 附录五 PKC Kinase Assay Kits,TypeⅠ试剂盒成分 | 第90-91页 |
| 致谢 | 第91-92页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第92页 |
