| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 1 绪论 | 第15-30页 |
| 1.1 手性化合物及其单体制备方法 | 第15-20页 |
| 1.1.1 手性化合物 | 第15-16页 |
| 1.1.2 手性单体的制备方法 | 第16-17页 |
| 1.1.2.1 从天然产物中分离提取 | 第16页 |
| 1.1.2.2 手性源合成 | 第16页 |
| 1.1.2.3 不对称合成 | 第16页 |
| 1.1.2.4 外消旋体拆分 | 第16-17页 |
| 1.1.3 手性化合物的的动态动力学拆分 | 第17-18页 |
| 1.1.4 (R)-邻氯扁桃酸衍生物及其动态动力学拆分 | 第18-20页 |
| 1.2 扁桃酸消旋酶概述 | 第20-22页 |
| 1.2.1 扁桃酸消旋酶简介 | 第20页 |
| 1.2.2 扁桃酸消旋酶的研究现状 | 第20-22页 |
| 1.3 酶分子的改造 | 第22-26页 |
| 1.3.1 理性设计 | 第23页 |
| 1.3.2 定向进化 | 第23-26页 |
| 1.3.2.1 突变体库的构建方法 | 第23-24页 |
| 1.3.2.2 高通量筛选方法 | 第24-26页 |
| 1.3.3 半理性设计 | 第26页 |
| 1.4 分子模拟 | 第26-29页 |
| 1.4.1 量子力学模拟 | 第27页 |
| 1.4.2 分子力学模拟 | 第27页 |
| 1.4.3 分子动力学模拟 | 第27-28页 |
| 1.4.4 蒙特卡洛法 | 第28页 |
| 1.4.5 分子对接 | 第28-29页 |
| 1.5 课题研究的内容、目的及意义 | 第29-30页 |
| 2 扁桃酸消旋酶高通量筛选方法的建立与验证 | 第30-41页 |
| 2.1 引言 | 第30-31页 |
| 2.2 材料与方法 | 第31-35页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第31-32页 |
| 2.2.1.1 菌株及质粒 | 第31页 |
| 2.2.1.2 试剂 | 第31-32页 |
| 2.2.1.3 仪器设备 | 第32页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第32-35页 |
| 2.2.2.1 D-MDH催化步骤的检验 | 第32-33页 |
| 2.2.2.2 HTS反应体系的优化 | 第33页 |
| 2.2.2.3 扁桃酸消旋酶高通量筛选方法的建立 | 第33-34页 |
| 2.2.2.4 HTS方法的验证 | 第34页 |
| 2.2.2.5 最适检测波长的确定 | 第34-35页 |
| 2.2.2.6 MR酶活与吸光值之间关系的建立 | 第35页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第35-40页 |
| 2.3.1 D-MDH专一性的验证 | 第35-36页 |
| 2.3.2 底物浓度对HTS的影响 | 第36页 |
| 2.3.3 D-MDH浓度对HTS的影响 | 第36-37页 |
| 2.3.4 反应时间对HTS的影响 | 第37-38页 |
| 2.3.5 HTS方法的建立与验证 | 第38-39页 |
| 2.3.6 DNPH及其衍生物的全波长扫描 | 第39页 |
| 2.3.7 MR酶活与吸光值之间的关系 | 第39-40页 |
| 2.4 小结 | 第40-41页 |
| 3 扁桃酸消旋酶的定向进化 | 第41-55页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 材料与方法 | 第41-51页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第41-43页 |
| 3.2.1.1 菌株及质粒 | 第41-42页 |
| 3.2.1.2 试剂与工具酶 | 第42页 |
| 3.2.1.3 仪器设备 | 第42-43页 |
| 3.2.2 实验方法 | 第43-51页 |
| 3.2.2.1 MR基因的易错PCR | 第43-44页 |
| 3.2.2.2 PCR产物与pET-30a质粒的酶切与连接 | 第44-45页 |
| 3.2.2.3 E.coli BL21感受态细胞的制备与转化 | 第45-46页 |
| 3.2.2.4 重组子的鉴定 | 第46-47页 |
| 3.2.2.5 突变体的培养与诱导表达 | 第47-48页 |
| 3.2.2.6 高通量筛选 | 第48页 |
| 3.2.2.7 组合突变 | 第48-50页 |
| 3.2.2.8 酶活检测 | 第50页 |
| 3.2.2.9 高效液相色谱分析 | 第50-51页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第51-54页 |
| 3.3.1 MR基因的扩增 | 第51页 |
| 3.3.2 重组子的菌落PCR验证 | 第51-52页 |
| 3.3.3 易错PCR体系条件的确定 | 第52-53页 |
| 3.3.4 进化结果与突变体的酶活检测 | 第53-54页 |
| 3.4 小结 | 第54-55页 |
| 4 扁桃酸消旋酶及其突变体的酶促反应动力学分析 | 第55-67页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 材料与方法 | 第55-61页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1.1 试剂 | 第55-56页 |
| 4.2.1.2 仪器设备 | 第56页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第56-61页 |
| 4.2.2.1 重组蛋白的诱导表达 | 第56-57页 |
| 4.2.2.2 蛋白的分离纯化 | 第57-58页 |
| 4.2.2.3 蛋白纯度的表征 | 第58-59页 |
| 4.2.2.4 蛋白浓度的测定 | 第59页 |
| 4.2.2.5 酶活分析与计算方法 | 第59-60页 |
| 4.2.2.6 温度和pH对酶催化反应的影响 | 第60页 |
| 4.2.2.7 动力学常数的测定 | 第60-61页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第61-66页 |
| 4.3.1 MR及其突变体的SDS-PAGE电泳分析 | 第61页 |
| 4.3.2 蛋白浓度的标准曲线 | 第61-62页 |
| 4.3.3 邻氯扁桃酸浓度-旋光值的标准曲线 | 第62-63页 |
| 4.3.4 最适反应温度 | 第63-64页 |
| 4.3.5 最适反应pH | 第64页 |
| 4.3.6 MR及其突变体的动力学分析 | 第64-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-67页 |
| 5 扁桃酸消旋酶的分子模拟 | 第67-78页 |
| 5.1 引言 | 第67页 |
| 5.2 材料与方法 | 第67-70页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 5.2.2 实验方法 | 第68-70页 |
| 5.2.2.1 扁桃酸消旋酶及其突变体二级结构的分析 | 第68页 |
| 5.2.2.2 扁桃酸消旋酶突变体结构的构建和分子对接 | 第68-69页 |
| 5.2.2.3 扁桃酸消旋酶的分子动力学模拟 | 第69-70页 |
| 5.2.2.4 模拟体系结合自由能的计算 | 第70页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第70-77页 |
| 5.3.1 野生型扁桃酸消旋酶及其突变体的圆二色谱分析 | 第70-71页 |
| 5.3.2 扁桃酸消旋酶与(S)-邻氯扁桃酸的分子对接分析 | 第71-73页 |
| 5.3.3 分子动力学模拟分析 | 第73-75页 |
| 5.3.4 模拟体系平衡情况的分析 | 第75-76页 |
| 5.3.5 模拟体系结合自由能及关键氨基酸贡献值的分析 | 第76-77页 |
| 5.4 小结 | 第77-78页 |
| 6 结论与展望 | 第78-80页 |
| 6.1 结论 | 第78-79页 |
| 6.2 展望 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 附录 | 第88-90页 |
| 作者筒历 | 第90页 |
