| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-46页 |
| 1.1 基因组定点编辑 | 第15-16页 |
| 1.2 人工锌指核酸酶 | 第16-22页 |
| 1.2.1 锌指蛋白的设计与组装 | 第17-19页 |
| 1.2.2 FokI内切酶 | 第19页 |
| 1.2.3 ZFN在基因组编辑中的应用 | 第19-22页 |
| 1.3 转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENS） | 第22-27页 |
| 1.3.1TALE的结构与DNA识别 | 第23-24页 |
| 1.3.2 TALENs的应用 | 第24-26页 |
| 1.3.3 TALENs特异性与脱靶 | 第26-27页 |
| 1.4 CRISPR/CAS9系统及应用 | 第27-39页 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统基因结构与类型 | 第28-29页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas的适应性免疫机制 | 第29-30页 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9基因组编辑机制 | 第30-33页 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9的应用 | 第33-36页 |
| 1.4.5 CRISPR/Cas9在基因组编辑中脱靶问题 | 第36-39页 |
| 1.5 维生素D受体研究进展 | 第39-45页 |
| 1.5.1 维生素D受体结构与功能 | 第40-41页 |
| 1.5.2 VDR调控基因的表达 | 第41-44页 |
| 1.5.3 VDR与细胞内蛋白因子的相互作用 | 第44-45页 |
| 1.6 本研究的目的和意义 | 第45-46页 |
| 第二章 VDR基因CRISPR/CAS9打靶系统构建 | 第46-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第46-47页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第46页 |
| 2.1.2 试剂 | 第46页 |
| 2.1.3 引物序列 | 第46-47页 |
| 2.2 实验方法 | 第47-51页 |
| 2.2.1 维生素D受体基因（VDR）CRISPR/Cas9打靶位点的选择 | 第47-48页 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9表达载体的构建 | 第48-50页 |
| 2.2.3 报告载体的设计与构建 | 第50-51页 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9活性与报告载体效果验证 | 第51页 |
| 2.3 实验结果 | 第51-54页 |
| 2.3.1 CRISPR/Cas9表达载体的鉴定 | 第51-52页 |
| 2.3.2 CRISPR/Cas9报告载体的鉴定 | 第52-53页 |
| 2.3.3 CRISPR/Cas9活性与报告载体效果 | 第53-54页 |
| 2.4 讨论 | 第54-55页 |
| 2.5 小结 | 第55-56页 |
| 第三章 CRISPR/CAS9介导VDR基因编辑 | 第56-66页 |
| 3.1 实验材料 | 第56-57页 |
| 3.1.1 细胞株和质粒 | 第56页 |
| 3.1.2 试剂和培养基的配制 | 第56页 |
| 3.1.3 PCR引物 | 第56-57页 |
| 3.2 实验方法 | 第57-59页 |
| 3.2.1 细胞转染与筛选 | 第57-58页 |
| 3.2.2 细胞基因组DNA提取与PCR扩增 | 第58页 |
| 3.2.3 T7E1酶切检测 | 第58页 |
| 3.2.4 TA克隆与测序 | 第58-59页 |
| 3.2.5 数字PCR检测大片段删除及效率 | 第59页 |
| 3.3 实验结果 | 第59-64页 |
| 3.3.1 CRISPR/Cas9靶向编辑人VDR基因的效率 | 第59-61页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9靶向编辑小鼠VDR基因的效率 | 第61页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9介导VDR基因大片段删除 | 第61-63页 |
| 3.3.4 细胞水平的脱靶效应 | 第63-64页 |
| 3.4 讨论 | 第64-65页 |
| 3.5 小结 | 第65-66页 |
| 第四章 VDR基因敲除小鼠模型的构建 | 第66-73页 |
| 4.1 实验材料 | 第66-67页 |
| 4.1.1 实验动物 | 第66页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第66-67页 |
| 4.2 实验方法 | 第67-68页 |
| 4.2.1 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录 | 第67页 |
| 4.2.2 超数排卵与受精卵的提取 | 第67页 |
| 4.2.3 假孕受体母鼠的准备 | 第67页 |
| 4.2.4 显微注射 | 第67页 |
| 4.2.5 受精卵的鉴定与移植 | 第67页 |
| 4.2.6 F0代的鉴定与靶位点突变分析 | 第67-68页 |
| 4.2.7 F0代VDR敲除鼠脱靶效应检测 | 第68页 |
| 4.3 实验结果 | 第68-71页 |
| 4.3.1 F0代小鼠生产与靶位点PCR扩增 | 第68-69页 |
| 4.3.2 F0代小鼠的T7E1检测 | 第69页 |
| 4.3.3 F0代小鼠靶位点PCR产物测序检测 | 第69-70页 |
| 4.3.4 F0代VDR基因敲除鼠脱靶突变检测 | 第70-71页 |
| 4.4 讨论 | 第71-72页 |
| 4.5 小结 | 第72-73页 |
| 第五章 VDR基因敲除鼠表型鉴定及相关基因表达分析 | 第73-79页 |
| 5.1 实验材料 | 第73-74页 |
| 5.1.1 实验动物 | 第73页 |
| 5.1.2 实验试剂 | 第73-74页 |
| 5.2 实验方法 | 第74页 |
| 5.2.1 VDR基因敲除鼠和野生型小鼠总RNA提取 | 第74页 |
| 5.2.2 定量PCR检测VDR及其相关基因的表达 | 第74页 |
| 5.2.3 免疫荧光检测VDR在不同组织的表达差异 | 第74页 |
| 5.2.4 表性分析 | 第74页 |
| 5.3 实验结果 | 第74-77页 |
| 5.3.1 敲除鼠和野生型小鼠VDR基因表达差异 | 第74-75页 |
| 5.3.2 敲除鼠和野生型小鼠VDR相关基因表达分析 | 第75-76页 |
| 5.3.3 敲除鼠表型分析 | 第76-77页 |
| 5.4 讨论 | 第77-78页 |
| 5.5 小结 | 第78-79页 |
| 第六章 慢病毒注射睾丸生产转CAS9基因小鼠 | 第79-87页 |
| 6.1 实验材料 | 第79-80页 |
| 6.1.1 实验动物 | 第79页 |
| 6.1.2 细胞系与菌株 | 第79页 |
| 6.1.3 病毒载体与病毒 | 第79页 |
| 6.1.4 实验试剂 | 第79-80页 |
| 6.2 实验方法 | 第80-81页 |
| 6.2.1 慢病毒质粒的制备 | 第80页 |
| 6.2.2 慢病毒包装与滴度测定 | 第80页 |
| 6.2.3 慢病毒注射小鼠睾丸 | 第80页 |
| 6.2.4 注射后小鼠睾丸组织免疫组化分析 | 第80-81页 |
| 6.2.5 F0代配种与F1代检测与分析 | 第81页 |
| 6.3 实验结果 | 第81-85页 |
| 6.3.1 慢病毒滴度检测 | 第81-82页 |
| 6.3.2 小鼠睾丸组织免疫组化检测 | 第82-84页 |
| 6.3.3 F1代小鼠的PCR检测 | 第84-85页 |
| 6.4 讨论 | 第85-86页 |
| 6.5 小结 | 第86-87页 |
| 结论 | 第87-88页 |
| 创新点 | 第88-89页 |
| 后续研究 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-104页 |
| 附录 | 第104-111页 |
| 缩略词 | 第111-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 作者简介 | 第113页 |
