| 摘要 | 第1-4页 |
| Summary | 第4-6页 |
| 外文缩略语表 | 第6-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-16页 |
| 1 牛支原体及其致病机理和诊断研究进展 | 第10-12页 |
| ·牛支原体 | 第10页 |
| ·牛支原体致病机理 | 第10-11页 |
| ·牛支原体相关疾病的诊断 | 第11-12页 |
| ·病原学诊断 | 第11页 |
| ·血清学诊断 | 第11页 |
| ·分子生物学诊断 | 第11-12页 |
| 2 丙酮酸脱氢酶复合体及其生物学功能 | 第12-14页 |
| ·丙酮酸脱氢酶复合体的结构组成 | 第12页 |
| ·丙酮酸脱氢酶复合体的催化作用机理 | 第12-13页 |
| ·丙酮酸脱氢酶E1的结构及功能特性 | 第13-14页 |
| ·丙酮酸脱氢酶在支原体的相关研究 | 第14页 |
| 4 本研究的目的意义 | 第14-16页 |
| 第二章 牛支原体PDH E1亚基基因的克隆及相关信息分析 | 第16-24页 |
| 1 材料 | 第16-18页 |
| ·菌种及载体 | 第16页 |
| ·仪器 | 第16页 |
| ·试剂 | 第16-18页 |
| ·主要试剂 | 第16-17页 |
| ·试剂配制 | 第17页 |
| ·培养基配制 | 第17-18页 |
| 2 方法 | 第18-20页 |
| ·牛支原体基因组的粗提 | 第18页 |
| ·pdhα 和pdhβ 基因的扩增及优化 | 第18-19页 |
| ·目的基因序列相似性及抗原表位初步预测 | 第19-20页 |
| 3 结果 | 第20-23页 |
| ·pdhα 和pdhβ 基因的扩增及序列分析 | 第20-21页 |
| ·pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析结果 | 第21-22页 |
| ·E1α、E1β 亚基抗原表位初步预测结果 | 第22-23页 |
| 4 讨论 | 第23-24页 |
| 第三章 牛支原体PDH E1亚基基因原核表达及亚细胞定位 | 第24-32页 |
| 1 材料 | 第24-26页 |
| ·菌种、载体及试验动物 | 第24页 |
| ·仪器 | 第24页 |
| ·试剂 | 第24-26页 |
| ·主要试剂 | 第24-25页 |
| ·试剂配制 | 第25-26页 |
| 2 方法 | 第26-27页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第26页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第26页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第26页 |
| ·膜蛋白提取 | 第26页 |
| ·E1a、β 亚基在牛支原体细胞内的分布 | 第26-27页 |
| ·Western-blot分析 | 第27页 |
| ·ELISA检测 | 第27页 |
| 3 结果 | 第27-29页 |
| ·原核表达质粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鉴定 | 第27-28页 |
| ·r PDHA及r PDHB的诱导表达 | 第28页 |
| ·E1a、β 亚基在牛支原体细胞内的分布 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-32页 |
| 第四章 牛支原体丙酮酸脱氢酶E1α 亚基单克隆抗体的制备 | 第32-41页 |
| 1 材料 | 第32-33页 |
| ·试验动物、菌株、细胞及抗原 | 第32页 |
| ·仪器 | 第32-33页 |
| ·主要试剂 | 第33页 |
| 2 方法 | 第33-37页 |
| ·BALB/c小鼠的免疫 | 第33页 |
| ·骨髓瘤细胞的培养 | 第33页 |
| ·饲养细胞的制备 | 第33-34页 |
| ·小鼠免疫脾细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·确定最佳抗原包被量 | 第35页 |
| ·骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的融合 | 第35页 |
| ·杂交瘤细胞的抗体检测 | 第35-36页 |
| ·阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选 | 第36页 |
| ·杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第36-37页 |
| ·单克隆抗体效价检测 | 第37页 |
| ·单克隆抗体特异性检测 | 第37页 |
| ·杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测 | 第37页 |
| 3 结果 | 第37-40页 |
| ·牛支原体抗原最佳包被浓度的确定 | 第37-38页 |
| ·细胞融合前小鼠尾血效价 | 第38页 |
| ·杂交瘤细胞株的建立 | 第38页 |
| ·单克隆抗体的生物学活性 | 第38-39页 |
| ·单克隆抗体效价 | 第38-39页 |
| ·单克隆抗体特异性 | 第39页 |
| ·杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测 | 第39-40页 |
| 4 讨论 | 第40-41页 |
| 第五章 牛支原体丙酮酸脱氢酶E1亚基的黏附特性研究 | 第41-47页 |
| 1 材料 | 第41-42页 |
| ·菌株、载体与细胞 | 第41页 |
| ·试剂 | 第41-42页 |
| 2 方法 | 第42-43页 |
| ·荧光表达载体的构建 | 第42页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第42页 |
| ·E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附试验 | 第42页 |
| ·E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附抑制试验 | 第42-43页 |
| 3 结果 | 第43-45页 |
| ·重组表达质粒的酶切鉴定 | 第43页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第43-44页 |
| ·E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp对NBL-4 细胞的黏附试验 | 第44页 |
| ·多抗血清对E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制试验 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-47页 |
| 全文结论 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 作者简介 | 第55-56页 |
| 导师简介 | 第56-58页 |
