角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质研究
| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 1 前言 | 第12-25页 |
| ·角蛋白的简介 | 第12页 |
| ·角蛋白酶的研究现状 | 第12-18页 |
| ·角蛋白酶的来源与分类 | 第12-13页 |
| ·角蛋白酶的性质 | 第13-14页 |
| ·分子量 | 第13页 |
| ·最适pH | 第13-14页 |
| ·最适温度 | 第14页 |
| ·各种离子和试剂的影响 | 第14页 |
| ·角蛋白酶的作用机制 | 第14-16页 |
| ·机械压力假设 | 第14-15页 |
| ·硫解作用假设 | 第15页 |
| ·膜电位假设 | 第15页 |
| ·复合酶假设 | 第15-16页 |
| ·角蛋白酶基因的研究 | 第16页 |
| ·角蛋白酶基因的异源表达 | 第16-17页 |
| ·角蛋白酶的应用 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第18-25页 |
| ·宿主细胞 | 第19页 |
| ·表达载体 | 第19-20页 |
| ·表达策略 | 第20-23页 |
| ·启动子 | 第20页 |
| ·信号肽 | 第20-21页 |
| ·G+C/A+T含量 | 第21-22页 |
| ·密码子偏好性 | 第22页 |
| ·基因剂量效应 | 第22-23页 |
| ·目的蛋白的稳定性 | 第23页 |
| ·发酵条件优化 | 第23-25页 |
| ·碳氮源 | 第23-24页 |
| ·温度 | 第24页 |
| ·pH值 | 第24页 |
| ·甲醇的添加速率 | 第24页 |
| ·溶氧值（DO） | 第24-25页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-37页 |
| ·材料 | 第25-28页 |
| ·菌株和质粒 | 第25页 |
| ·培养基和抗生素 | 第25-26页 |
| ·实验试剂和溶液 | 第26-28页 |
| ·仪器 | 第28页 |
| ·角蛋白酶基因的优化克隆与测序 | 第28-31页 |
| ·角蛋白酶基因密码子的优化 | 第28-29页 |
| ·基因序列的PCR扩增与酶切 | 第29-30页 |
| ·目的基因与质粒载体的酶连反应 | 第30页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第30-31页 |
| ·角蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第31-33页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| ·高拷贝重组菌的筛选 | 第33页 |
| ·角蛋白酶基因的表达及产物的检测 | 第33-34页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第33页 |
| ·TCA沉淀 | 第33-34页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测 | 第34页 |
| ·酶学性质研究 | 第34-36页 |
| ·角蛋白酶活的测定 | 第34-35页 |
| ·粗酶液最适反应温度、pH及温度、pH的稳定性 | 第35页 |
| ·粗酶液最适反应pH | 第35页 |
| ·粗酶液的温度稳定性 | 第35页 |
| ·粗酶液的pH稳定性 | 第35页 |
| ·不同金属离子对粗酶液的影响 | 第35页 |
| ·有机溶剂和表面活性剂对粗酶液的影响 | 第35-36页 |
| ·底物特异性 | 第36页 |
| ·动力学常数的测定 | 第36页 |
| ·高密度细胞发酵 | 第36-37页 |
| ·种子液的培养 | 第36页 |
| ·菌体生长阶段 | 第36-37页 |
| ·甲醇诱导表达阶段 | 第37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-50页 |
| ·密码子优化 | 第37-40页 |
| ·角蛋白酶基因CAI值优化前后比较 | 第37-38页 |
| ·角蛋白酶基因GC含量优化前后比较 | 第38页 |
| ·角蛋白酶基因mRNA二级结构优化前后比较 | 第38-40页 |
| ·毕赤酵母表达 | 第40-44页 |
| ·角蛋白酶基因kerUS的PCR扩增 | 第40页 |
| ·重组质粒的构建与验证 | 第40-42页 |
| ·重组酵母的验证 | 第42-43页 |
| ·G418抗性平板筛选高拷贝数重组菌株 | 第43-44页 |
| ·SDS-PAGE检测表达产物 | 第44页 |
| ·酶学性质分析 | 第44-49页 |
| ·BCA标准曲线的制作 | 第44-45页 |
| ·角蛋白酶的最适反应温度、pH和温度、pH稳定性 | 第45-46页 |
| ·不同金属离子对角蛋白酶活性的影响 | 第46-47页 |
| ·表面活性剂对角蛋白酶活性的影响 | 第47页 |
| ·有机试剂对角蛋白酶活性的影响 | 第47-48页 |
| ·底物特异性 | 第48页 |
| ·酶学动力学常数测定 | 第48-49页 |
| ·高密度细胞培养 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-55页 |
| ·密码子优化 | 第50-51页 |
| ·基因合成技术 | 第51-52页 |
| ·高拷贝目的基因的获得与筛选 | 第52页 |
| ·高密度细胞发酵条件的控制 | 第52-54页 |
| ·温度 | 第53页 |
| ·溶氧 | 第53页 |
| ·甲醇添加量 | 第53-54页 |
| ·展望 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
