人粒细胞集落刺激因子的基因合成、原核表达与活性研究
| 第一章 前言 | 第1-13页 |
| ·粒细胞集落刺激因子(G-CSF)研究简史 | 第8-10页 |
| ·G-CSF的来源和结构 | 第10页 |
| ·G-CSF的应用 | 第10-12页 |
| ·本研究目的与意义 | 第12-13页 |
| 第二章 试剂与方法 | 第13-27页 |
| ·试剂和材料 | 第13页 |
| ·设备和仪器 | 第13页 |
| ·合成单链寡核苷酸的溶解 | 第13页 |
| ·基于DA-PCR的单链延伸反应 | 第13-14页 |
| ·基于OE-PCR的双链拼接反应 | 第14-15页 |
| ·质粒DNA的提取方法 | 第15-16页 |
| ·限制性酶切反应 | 第16页 |
| ·重组载体连接反应 | 第16页 |
| ·重组载体的电击转化 | 第16-18页 |
| ·挑取的阳性克隆提取质粒后进行PCR法鉴定 | 第18页 |
| ·总RNA提取 | 第18-20页 |
| ·hG-CSF的cDNA钓取 | 第20-21页 |
| ·表达载体构建 | 第21-22页 |
| ·表达蛋白检测 | 第22-24页 |
| ·蛋白表达量影响因素考察 | 第24页 |
| ·成熟蛋白的制备 | 第24-25页 |
| ·生物学活性测定法 | 第25-27页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第27-50页 |
| ·G-CSF的氨基酸序列 | 第27页 |
| ·编码所使用大肠杆菌密码子频率表 | 第27-28页 |
| ·大肠杆菌偏爱密码子编码的人G-CSF基因 | 第28-30页 |
| ·拟合成序列全长 | 第30页 |
| ·单链引物的拆分 | 第30-31页 |
| ·合成方案 | 第31-32页 |
| ·基因合成结果 | 第32-33页 |
| ·人血细胞总RNA提取 | 第33页 |
| ·hG-CSF的cDNA钓取结果 | 第33-34页 |
| ·测序载体pUC-CSF的构建与转化 | 第34-35页 |
| ·测序结果 | 第35-36页 |
| ·重组载体pET-CSF构建 | 第36-37页 |
| ·重组载体pET-CSF表达蛋白全菌体检测 | 第37-38页 |
| ·外源蛋白表达量影响因素考察 | 第38-41页 |
| ·密码子选择对表达量的影响 | 第41-42页 |
| ·表达蛋白可溶性分析 | 第42-43页 |
| ·G-CSF的亲和层析与成熟纯化 | 第43-44页 |
| ·G-CSF的Western blot检测 | 第44页 |
| ·G-CSF的ELISA检测 | 第44-47页 |
| ·rhG-CSF生物活性检测 | 第47-50页 |
| 第四章 结论 | 第50-52页 |
| 参考文献 | 第52-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 中文摘要 | 第57-58页 |
| Abstract | 第58页 |
