| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 第一篇 文献综述 | 第14-34页 |
| 第一章 嗜水气单胞菌检测技术研究进展 | 第14-24页 |
| 1 嗜水气单胞菌概况 | 第14-15页 |
| ·嗜水气单胞菌生物学特性 | 第14页 |
| ·嗜水气单胞菌血清学分型 | 第14页 |
| ·嗜水气单胞菌致病因子 | 第14-15页 |
| ·嗜水气单胞菌流行病学及病症 | 第15页 |
| 2 嗜水气单胞菌检测技术 | 第15-19页 |
| ·常规生化鉴定方法 | 第15-16页 |
| ·选择性培养基 | 第16页 |
| ·分子生物学检测方法 | 第16-17页 |
| ·聚合酶链式反应 | 第16页 |
| ·基因芯片 | 第16-17页 |
| ·核酸探针技术 | 第17页 |
| ·免疫学技术 | 第17-18页 |
| ·SPA协同凝集试验 | 第17页 |
| ·免疫荧光技术 | 第17-18页 |
| ·酶联免疫吸附试验 | 第18页 |
| ·其他方法 | 第18-19页 |
| 3 结语 | 第19-20页 |
| 参考文献 | 第20-24页 |
| 第二章 单链抗体的制备技术及应用发展 | 第24-34页 |
| 1 抗体的分子结构 | 第24页 |
| 2 单链抗体的结构 | 第24-25页 |
| 3 单链抗体的特点和改造类型 | 第25页 |
| ·单链抗体的特点 | 第25页 |
| ·单链抗体的改造类型 | 第25页 |
| 4 单链抗体的基因来源 | 第25页 |
| 5 单链抗体的表达系统 | 第25-27页 |
| ·原核细胞表达系统 | 第25-26页 |
| ·真核细胞表达系统 | 第26-27页 |
| ·酵母表达系统 | 第26页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统 | 第26-27页 |
| ·昆虫细胞表达系统 | 第27页 |
| ·植物细胞表达系统 | 第27页 |
| 6 单链抗体在动物疾病研究中的应用 | 第27-29页 |
| ·应用于靶向载体 | 第27-28页 |
| ·应用于抑制病毒复制 | 第28页 |
| ·应用于病原菌检测 | 第28页 |
| ·应用于体内寄生虫的防治 | 第28-29页 |
| 7 单链抗体技术发展存在的问题 | 第29-30页 |
| 参考文献 | 第30-34页 |
| 第二篇 试验研究 | 第34-76页 |
| 第三章 鲫鱼IGM单链抗体融合基因的构建和表达 | 第34-60页 |
| 摘要 | 第34页 |
| 1 实验材料 | 第34-35页 |
| ·菌种与载体 | 第34-35页 |
| ·细胞株 | 第35页 |
| ·主要试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35页 |
| 2 实验方法 | 第35-47页 |
| ·杂交瘤细胞株的复苏 | 第35页 |
| ·杂交瘤细胞的亚克隆 | 第35-36页 |
| ·饲养细胞的制备 | 第35-36页 |
| ·有限稀释法筛选 | 第36页 |
| ·杂交瘤细胞总RNA的提取 | 第36-37页 |
| ·反转录合成cDNA | 第37页 |
| ·可变区基因的克隆及鉴定 | 第37-40页 |
| ·引物设计 | 第37-38页 |
| ·单克隆抗体可变区基因的扩增 | 第38页 |
| ·PCR产物凝胶电泳回收与纯化 | 第38-39页 |
| ·PCR产物连接转入T-vector | 第39页 |
| ·DH5α感受态细胞的制备 | 第39页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌DH5α | 第39-40页 |
| ·菌液PCR鉴定 | 第40页 |
| ·质粒的小量制备 | 第40页 |
| ·单链抗体基因(F3a-scFv)的构建 | 第40-43页 |
| ·拼接F3a-scFv基因的引物设计与合成 | 第40-41页 |
| ·重链可变区DNA的准备 | 第41-42页 |
| ·轻链可变区DNA的准备 | 第42页 |
| ·重叠延伸PCR拼接F3a-scFv全长基因 | 第42-43页 |
| ·构建19T/F3a-scFv重组质粒并转化大肠杆菌DH5α | 第43页 |
| ·菌液PCR鉴定并送测序 | 第43页 |
| ·质粒的小量制备 | 第43页 |
| ·pET 32a-F3a-scFv重组表达载体的构建 | 第43-44页 |
| ·原核表达载体pET 32a(+)与重组克隆抗体F3a-scFv的限制性内切酶消化及胶回收 | 第43页 |
| ·连接反应 | 第43-44页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌DH5α | 第44页 |
| ·阳性克隆质粒的提取及酶切鉴定 | 第44页 |
| ·pET32a-F3a-scFv融合蛋白的原核表达 | 第44-46页 |
| ·感受态细胞BL21(DE3)的制备及重组质粒pET32a-F3a-scFv的转化 | 第44页 |
| ·pET32a-F3a-scFv融合蛋白的诱导表达 | 第44-46页 |
| ·F3a-scFv生物学活性分析 | 第46页 |
| ·Western Blotting检测F3a-scFv复性蛋白 | 第46页 |
| ·间接ELISA法鉴定F3a-scFv的活性 | 第46页 |
| ·F3a-scFv酶标抗体的制备 | 第46-47页 |
| 3 结果 | 第47-54页 |
| ·杂交瘤细胞的亚克隆与抗体亚类 | 第47页 |
| ·杂交瘤细胞总RNA的提取与反转录合成cDNA | 第47页 |
| ·可变区基因V_L、V_H的扩增 | 第47页 |
| ·重组质粒pMD 19T/X的筛选(X为克隆的目的片段) | 第47-48页 |
| ·可变区基因的测序结果 | 第48-49页 |
| ·单链抗体基因(F3a-scFv)的构建 | 第49-51页 |
| ·V_H-Linker和Liner-V_L的扩增 | 第49-50页 |
| ·F3a-scFv全长基因的拼接 | 第50页 |
| ·测序结果分析 | 第50-51页 |
| ·pET 32a-F3a-scFv重组表达载体的构建 | 第51-52页 |
| ·pET 32a-F3a-scFv融合蛋白的诱导表达 | 第52-53页 |
| ·F3a-scFv抗原结合活性 | 第53-54页 |
| ·F3a-scFv与鲫鱼IgM的Western Blotting结果分析 | 第53-54页 |
| ·间接ELISA测定F3a-scFv的活性 | 第54页 |
| ·F3a-scFv酶标抗体的制备 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-58页 |
| ·scFv基因的构建 | 第55页 |
| ·scFv的表达 | 第55-56页 |
| ·scFv基因序列分析 | 第56页 |
| ·scFv蛋白的纯化、复性和浓缩 | 第56-57页 |
| ·scFv活性的测定 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-59页 |
| ABSTRACT | 第59-60页 |
| 第四章 嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立 | 第60-76页 |
| 摘要 | 第60-61页 |
| 1 实验材料 | 第61页 |
| ·实验动物及菌株 | 第61页 |
| ·主要试剂及实验仪器 | 第61页 |
| 2 实验方法 | 第61-65页 |
| ·全菌抗原的制备 | 第61-62页 |
| ·血清的制备 | 第62页 |
| ·阳性血清的制备 | 第62页 |
| ·阴性血清的制备 | 第62页 |
| ·不同免疫时期鲫鱼免疫血清的制备 | 第62页 |
| ·不同感染时期鲫鱼免疫血清的制备 | 第62页 |
| ·间接ELISA实验操作步骤 | 第62-63页 |
| ·全菌包被抗原的制备 | 第62-63页 |
| ·包被 | 第63页 |
| ·封闭 | 第63页 |
| ·加鱼血清(一抗) | 第63页 |
| ·加HRP-scFv(二抗) | 第63页 |
| ·显色和终止 | 第63页 |
| ·结果判定 | 第63页 |
| ·间接ELISA最佳反应条件的选择 | 第63-65页 |
| ·包被抗原和一抗最佳工作浓度的选择 | 第63-64页 |
| ·抗原最适包被条件的选择 | 第64页 |
| ·封闭液和封闭时间的选择 | 第64页 |
| ·一抗血清最佳反应时间的选择 | 第64页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择 | 第64页 |
| ·显色时间的确定 | 第64页 |
| ·Cut-off值的确定 | 第64-65页 |
| ·敏感性试验 | 第65页 |
| ·重复性试验 | 第65页 |
| ·批次内重复性试验 | 第65页 |
| ·批次间重复性试验 | 第65页 |
| ·不同免疫及感染时期鲫鱼IgM抗体水平的检测 | 第65页 |
| 3 结果 | 第65-71页 |
| ·间接ELISA最佳反应条件的选择 | 第65-69页 |
| ·包被抗原和一抗最佳工作浓度的确定 | 第65-66页 |
| ·抗原最适包被条件的确定 | 第66页 |
| ·封闭液和封闭时间的确定 | 第66-67页 |
| ·一抗血清最适作用时间的确定 | 第67页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择 | 第67-68页 |
| ·显色时间的确定 | 第68页 |
| ·Cut-off值的确定 | 第68-69页 |
| ·敏感性试验 | 第69页 |
| ·重复性试验 | 第69-70页 |
| ·批次内重复性试验 | 第69-70页 |
| ·批次间重复性试验 | 第70页 |
| ·不同免疫及感染时期鲫鱼血清抗体水平的检测 | 第70-71页 |
| 4 讨论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-74页 |
| ABSTRACT | 第74-76页 |
| 全文总结 | 第76-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
