| 致谢 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| 文献综述 | 第11-27页 |
| ·主动外排耐药机制 | 第11-12页 |
| ·主动外排机制及其调控因子 | 第12-20页 |
| ·主动外排机制的特点 | 第12-14页 |
| ·AcrAB-TolC系统的结构及功能 | 第14-16页 |
| ·大肠杆菌AcrAB-TolC外输泵引起不同类药物的作用机制 | 第16-17页 |
| ·AcrAB-TolC系统的调节因子的调控机制 | 第17-20页 |
| ·应对主动外排的策略 | 第20-21页 |
| ·对现有抗生素药物进行修饰绕开外排系统 | 第20页 |
| ·微生物外排泵抑制剂的开发 | 第20页 |
| ·阻断外排能量来源的抑制剂 | 第20页 |
| ·竞争性外排蛋白抑制剂 | 第20-21页 |
| ·干扰外排泵组装的抑制剂 | 第21页 |
| ·从具有治疗活性的药物中筛选 | 第21页 |
| ·Red同源重组技术研究进展 | 第21-25页 |
| ·Red重组系统的结构及其重组机制 | 第21-23页 |
| ·Red重组系统的应用与前景展望 | 第23-25页 |
| ·耐药基因检测及基因表达差异 | 第25-27页 |
| ·耐药基因的检测方法 | 第25页 |
| ·耐药基因的mRNA表达差异 | 第25页 |
| ·Real-Time PCR的原理 | 第25-27页 |
| 第一章 鸭大肠杆菌AcrB基因缺失株的构建 | 第27-43页 |
| 引言 | 第27页 |
| 1 材料 | 第27-29页 |
| ·菌株与质粒 | 第27-28页 |
| ·培养基和主要试剂 | 第28页 |
| ·药品 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28-29页 |
| 2 方法 | 第29-35页 |
| ·培养基和药液的配置 | 第29-30页 |
| ·SOB及SOC液体培养基的配制 | 第29页 |
| ·LB/Amp/X-gal/IPTG平板 | 第29页 |
| ·药液的制备 | 第29-30页 |
| ·PCR引物的设计 | 第30页 |
| ·质粒的提取 | 第30-31页 |
| ·融合PCR产物的制备和纯化 | 第31-33页 |
| ·短同源臂打靶DNA片段的制备 | 第31-32页 |
| ·长同源臂打靶DNA片段的制备 | 第32-33页 |
| ·感受态细胞的制备和Red重组功能的诱导 | 第33-35页 |
| ·CaCl_2法制备大肠杆菌O73(CVCC1547)感受态细胞 | 第33页 |
| ·质粒pKD46的转化 | 第33页 |
| ·O73/pKD46的验证 | 第33-34页 |
| ·O73/pKD46感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·打靶DNA片段的电击转化 | 第34页 |
| ·同源重组菌O73△acrB的PCR鉴定 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-40页 |
| ·pKD46、pKD4质粒的验证 | 第35页 |
| ·质粒pKD46的转化入大肠杆菌O73感受态细胞 | 第35页 |
| ·短同源臂融合PCR产物的制备 | 第35-36页 |
| ·融合PCR产物电转化至O73/pKD46 | 第36-37页 |
| ·长同源臂DNA片段的制备 | 第37-40页 |
| ·上、中、下三个片段的扩增与验证 | 第37-38页 |
| ·上、中、下三段基因片段的连接与验证 | 第38-39页 |
| ·长同源臂PCR产物的电击转化 | 第39-40页 |
| ·acrB基因敲除前后的鸭源大肠杆菌对抗生素的敏感性测定 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| ·基因敲除 | 第40-41页 |
| ·长同源臂和短同源臂的转化效率差异 | 第41页 |
| ·Red同源重组技术的注意事项 | 第41-42页 |
| 5 小结 | 第42-43页 |
| 第二章 acrB基因敲除前后的O73及其不同药物诱导菌株相关基因的mRNA的表达水平测定 | 第43-56页 |
| 引言 | 第43页 |
| 1 材料与方法 | 第43-47页 |
| ·材料 | 第43页 |
| ·菌株、药物 | 第43页 |
| ·试剂 | 第43页 |
| ·仪器 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-47页 |
| ·药物的配制 | 第43-44页 |
| ·细菌菌液的制备 | 第44页 |
| ·耐药菌的诱导 | 第44页 |
| ·相关调节基因、外排系统基因的mRNA表达水平 | 第44-47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-54页 |
| ·诱导后的菌株药物敏感性测定 | 第47-48页 |
| ·主动外排基因和调控基因mRNA的表达水平 | 第48-54页 |
| ·各个引物Real Time SYBR Green PCR融解曲线 | 第48-50页 |
| ·各个基因荧光定量PCR扩增曲线 | 第50-52页 |
| ·主动外排基因和其调控基因的mRNA表达水平 | 第52-54页 |
| 3 讨论 | 第54-55页 |
| ·荧光定量PCR方法及其应用 | 第54页 |
| ·各主动外排基因的外排底物 | 第54-55页 |
| 4 小结 | 第55-56页 |
| 本文创新点 | 第56-57页 |
| 英文摘要 | 第57-59页 |
| 附录 英文缩略词表 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
