| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-21页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶概述 | 第11-14页 |
| ·谷氨酰胺转胺酶来源及催化特性研究 | 第11页 |
| ·TGase 的应用 | 第11-12页 |
| ·TGase 的生产 | 第12页 |
| ·链霉菌 TGase 结构 | 第12-14页 |
| ·链霉菌 TGase 前导肽结构和功能研究 | 第14-16页 |
| ·TGase 前导肽结构 | 第14页 |
| ·TGase 前导肽功能研究 | 第14页 |
| ·前导肽工程研究进展 | 第14-16页 |
| ·蛋白质热稳定性影响因素研究 | 第16-17页 |
| ·氨基酸组成偏好性 | 第16页 |
| ·疏水相互作用 | 第16页 |
| ·氢键作用 | 第16-17页 |
| ·二硫键 | 第17页 |
| ·芳香环相互作用 | 第17页 |
| ·离子键 | 第17页 |
| ·蛋白分子改造策略 | 第17-19页 |
| ·非理性设计 | 第17-18页 |
| ·理性设计 | 第18-19页 |
| ·TGase 酶分子改造进展 | 第19页 |
| ·TGase 酶非理性改造 | 第19页 |
| ·TGase 酶理性改造 | 第19页 |
| ·选题的立题依据、研究意义及主要研究内容 | 第19-21页 |
| ·立题依据及研究意义 | 第19-20页 |
| ·本文主要研究内容 | 第20-21页 |
| 第二章 S. hygroscopicus TGase 前导肽功能分析 | 第21-34页 |
| ·前言 | 第21页 |
| ·材料与方法 | 第21-25页 |
| ·菌株和质粒 | 第21页 |
| ·试剂和仪器 | 第21-22页 |
| ·培养基及培养条件 | 第22页 |
| ·DNA 操作 | 第22页 |
| ·前导肽突变体的构建 | 第22-24页 |
| ·pro-TGase 的体外活化及 TGase 酶活力测定 | 第24页 |
| ·TGase 蛋白纯化 | 第24页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第24页 |
| ·TGase 酶学性质测定 | 第24-25页 |
| ·pro-TGase 晶体结构模拟及结构分析 | 第25页 |
| ·结果与讨论 | 第25-33页 |
| ·S. hygroscopicus pro-TGase 结构模拟及分析 | 第25页 |
| ·前导肽和成熟酶之间氢键功能分析 | 第25-27页 |
| ·缺失前导肽 C 端 -螺旋~(37-42)和 loop~(43-52) | 第27页 |
| ·前导肽 C 端氨基酸缺失突变体发酵过程检测 | 第27-29页 |
| ·前导肽 C 端氨基酸缺失突变酶结构模拟 | 第29-30页 |
| ·前导肽 C 端 -螺旋~(37-42)氨基酸突变体酶学性质分析 | 第30-32页 |
| ·突变酶 pro-37-42GGG 前导肽切割效率研究 | 第32-33页 |
| ·本章小结 | 第33-34页 |
| 第三章 前导肽 C 端插入短肽提高 TGase 催化活性和热稳定性 | 第34-44页 |
| ·前言 | 第34页 |
| ·材料方法 | 第34-35页 |
| ·菌株和质粒 | 第34页 |
| ·试剂和仪器 | 第34页 |
| ·培养基及培养条件 | 第34页 |
| ·DNA 操作 | 第34页 |
| ·突变体的构建 | 第34页 |
| ·pro-TGase 体外活化及 TGase 活力测定 | 第34页 |
| ·TGase 蛋白纯化 | 第34-35页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第35页 |
| ·TGase 酶学性质检测 | 第35页 |
| ·圆二色谱仪分析蛋白二级结构 | 第35页 |
| ·pro-TGase 及其突变体结构模拟 | 第35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-43页 |
| ·前导肽 C 端插入短肽突变体酶学性质检测 | 第35-38页 |
| ·突变酶 pro-52GGGG，pro-52GS 和 pro-52PT 结构模拟 | 第38-39页 |
| ·前导肽 C 端插入短肽的选择 | 第39-40页 |
| ·突变体酶学性质检测 | 第40-41页 |
| ·CD 检测突变酶 pro-tag 10 二级结构 | 第41页 |
| ·突变酶 pro-tag10 结构模拟及分析 | 第41-43页 |
| ·本章小结 | 第43-44页 |
| 第四章 TGase N 端氨基酸缺失及饱和突变提高 TGase 催化活性和热稳定性 | 第44-54页 |
| ·前言 | 第44页 |
| ·材料方法 | 第44-46页 |
| ·菌株和质粒 | 第44页 |
| ·试剂和仪器 | 第44页 |
| ·培养基及培养条件 | 第44页 |
| ·DNA 操作 | 第44页 |
| ·突变体的构建 | 第44-45页 |
| ·pro-TGase 活化及 TGase 活力测定 | 第45页 |
| ·TGase 蛋白纯化 | 第45页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第45页 |
| ·TGase 酶学性质检测 | 第45-46页 |
| ·CD 分析蛋白二级结构 | 第46页 |
| ·pro-TGase 及其突变体结构模拟 | 第46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-52页 |
| ·TGase N 端氨基酸缺失突变体酶学性质比较 | 第46-47页 |
| ·TGase 成熟酶 N 端氨基酸缺失突变体结构模拟 | 第47-48页 |
| ·突变酶 Del1-4 的 N 端氨基酸 E62 饱和突变 | 第48-49页 |
| ·突变酶酶学性质分析 | 第49-51页 |
| ·CD 检测突变酶 Del1-4/E62D 二级结构 | 第51页 |
| ·突变酶结构模拟 | 第51-52页 |
| ·本章小结 | 第52-54页 |
| 第五章 TGase C 端氨基酸功能鉴定及融合短肽提高其热稳定性 | 第54-62页 |
| ·前言 | 第54页 |
| ·材料方法 | 第54-56页 |
| ·菌株和质粒 | 第54页 |
| ·试剂和仪器 | 第54页 |
| ·培养基及培养条件 | 第54页 |
| ·DNA 操作 | 第54页 |
| ·突变体的构建 | 第54-55页 |
| ·pro-TGase 体外活化及 TGase 活力测定 | 第55页 |
| ·TGase 蛋白纯化 | 第55页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第55页 |
| ·TGase 酶学性质检测 | 第55页 |
| ·CD 分析蛋白二级结构 | 第55页 |
| ·荧光光谱分析 | 第55页 |
| ·pro-TGase 及其突变体结构模拟 | 第55-56页 |
| ·结果与讨论 | 第56-61页 |
| ·TGase C 端氨基酸缺失突变体发酵和酶学性质检测 | 第56-57页 |
| ·TGase C 端氨基酸结构分析 | 第57-58页 |
| ·TGase C 端氨基酸 W388 定点突变 | 第58-59页 |
| ·TG-tag1 构建及酶学性质检测 | 第59-60页 |
| ·TG-tag 荧光光谱检测及疏水性测定 | 第60页 |
| ·TG-tag1 结构模拟及分析 | 第60-61页 |
| ·本章小结 | 第61-62页 |
| 第六章 重组大肠杆菌高密度发酵生产 S. hygroscopicus pro-TGase | 第62-71页 |
| ·前言 | 第62页 |
| ·材料方法 | 第62-64页 |
| ·菌株和质粒 | 第62页 |
| ·试剂和仪器 | 第62页 |
| ·培养基及培养条件 | 第62-63页 |
| ·DNA 操作 | 第63页 |
| ·突变体的构建 | 第63页 |
| ·pro-TGase 体外活化及 TGase 活力测定 | 第63页 |
| ·TGase 蛋白纯化 | 第63页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析及蛋白浓度测定 | 第63页 |
| ·TGase 酶学性质检测 | 第63页 |
| ·甘油和乙酸测定 | 第63页 |
| ·pro-TGase 及其突变体结构模拟 | 第63-64页 |
| ·结果与讨论 | 第64-69页 |
| ·TGase 酶组合突变体的构建 | 第64页 |
| ·E62D-pro-tag10 和 E62D-tag1 酶学性质检测 | 第64-65页 |
| ·重组突变体 E62D-tag1 分批发酵 | 第65-66页 |
| ·重组突变体 E62D-tag1 高密度发酵生产 pro-TGase | 第66-67页 |
| ·诱导时间对重组突变体 E62D-tag1 高密度发酵生产 pro-TGase 的影响 | 第67-68页 |
| ·甘氨酸和钙离子添加时间对 E62D-tag1 分泌影响 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-71页 |
| 主要结论与展望 | 第71-73页 |
| 主要结论 | 第71-72页 |
| 展望 | 第72-73页 |
| 论文主要创新点 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-82页 |
| 附录 | 第82-83页 |
