| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第12-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-32页 |
| 1 聚羟基脂肪酸酯 | 第14-23页 |
| ·PHA简介 | 第14-15页 |
| ·PHA的形成模型 | 第15-16页 |
| ·聚羟基丁酸酯 | 第16-20页 |
| ·PHB的生物合成 | 第16-17页 |
| ·PHB颗粒表面相关蛋白 | 第17-20页 |
| ·PHA合酶 | 第18-19页 |
| ·phasins蛋白 | 第19-20页 |
| ·PHB颗粒的应用 | 第20-23页 |
| ·蛋白质纯化 | 第21-22页 |
| ·生物纳米粒/微粒 | 第22页 |
| ·靶向药物运输 | 第22-23页 |
| 2 重组人组织纤溶酶原激活剂 | 第23-26页 |
| ·rPA的结构和功能 | 第23-24页 |
| ·硫键的形成 | 第24-26页 |
| ·硫键形成的化学机制 | 第24页 |
| ·周质空间中二硫键的形成 | 第24页 |
| ·细胞质中二硫键的形成 | 第24-26页 |
| ·rPA的表达 | 第26页 |
| 3 外源大片段在基因组上的整合 | 第26-30页 |
| ·Red同源重组技术 | 第27-28页 |
| ·噬菌体整合技术 | 第28页 |
| ·大片段整合技术 | 第28-30页 |
| 4 本论文的目的和意义 | 第30-32页 |
| 第二章 重组人组织纤溶酶原激活剂在PHB颗粒表面 #25的活性展示 | 第32-59页 |
| 1 实验材料 | 第33-38页 |
| ·菌株 | 第33页 |
| ·质粒 | 第33页 |
| ·酶及试剂 | 第33-34页 |
| ·常用试剂盒 | 第34页 |
| ·仪器与设备 | 第34-35页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第35-38页 |
| ·培养基 | 第35-36页 |
| ·常用试剂 | 第36-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-47页 |
| ·构建融合表达载体 | 第39-44页 |
| ·pSKPA的构建 | 第39-43页 |
| ·引物设计 | 第39页 |
| ·PCR扩增phaP基因 | 第39页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第39-40页 |
| ·载体质粒的提取 | 第40-41页 |
| ·双酶切反应和连接反应 | 第41-42页 |
| ·普通感受态的制备(CaCl_2转化法) | 第42页 |
| ·普通感受态的转化 | 第42页 |
| ·重组子的筛选与鉴定 | 第42-43页 |
| ·pSPAr的构建 | 第43-44页 |
| ·PCR扩增rPA基因 | 第43-44页 |
| ·双酶切反应和连接反应 | 第44页 |
| ·转化和重组子的验证 | 第44页 |
| ·PHB和rPA共表达菌株的构建 | 第44-45页 |
| ·PHB合成菌株的构建 | 第44页 |
| ·PHB的合成 | 第44页 |
| ·尼罗红染色及荧光显微镜观察 | 第44页 |
| ·PHB含量的测定 | 第44-45页 |
| ·PHB和rPA共表达菌株的构建 | 第45页 |
| ·rPA和PHB的共表达 | 第45页 |
| ·rPA的检测 | 第45-47页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| ·western blot分析 | 第46页 |
| ·活性和含量分析 | 第46-47页 |
| ·rPA的活性检测 | 第46-47页 |
| ·rPA的含量测定 | 第47页 |
| ·rPA的纯化 | 第47页 |
| ·PHB颗粒的分离 | 第47页 |
| ·rPA的纯化 | 第47页 |
| 3 结果 | 第47-54页 |
| ·PhaP-rPA融合蛋白表达载体的构建 | 第47-49页 |
| ·载有phaP基因的重组质粒的构建和检测 | 第47-48页 |
| ·PhaP-rPA融合蛋白表达载体的构建和检测 | 第48-49页 |
| ·PHB和PhaP-rPA融合蛋白共表达菌株的构建及发酵 | 第49-54页 |
| ·宿主菌株的筛选 | 第49-50页 |
| ·Phap-rPA融合蛋白的表面展示 | 第50-54页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第50页 |
| ·western blot分析 | 第50-51页 |
| ·溶纤维蛋白活性检测 | 第51-53页 |
| ·rPA的分离 | 第53页 |
| ·rPA表达条件的优化 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-58页 |
| ·PHB合成对rPA活性的影响 | 第55-57页 |
| ·rpoS启动子对rPA表达的影响 | 第57页 |
| ·PhaP蛋白对rPA表达的影响 | 第57-58页 |
| 5 本章小结 | 第58-59页 |
| 第三章 稳定合成PHB重组E.coli的构建和优化 | 第59-76页 |
| 1 实验材料 | 第61-66页 |
| ·菌株和质粒 | 第61页 |
| ·实验方法 | 第61-66页 |
| ·poxB基因的敲除 | 第62-63页 |
| ·PHB operon在基因组上的整合 | 第63-65页 |
| ·PHB的合成 | 第65页 |
| ·多拷贝启动子PMtac替换Ptac | 第65页 |
| ·菌株的发酵 | 第65-66页 |
| 2 实验结果 | 第66-74页 |
| ·poxB基因的敲除 | 第66页 |
| ·pTKPHB质粒的构建 | 第66-69页 |
| ·DH5a-E ApoxB::tet(pTKRED+pTKPHB)菌株的构建 | 第69页 |
| ·PHB operon在E.coli基因组上的整合 | 第69-70页 |
| ·pTKRED质粒的去除 | 第70页 |
| ·Kan抗性的去除 | 第70-71页 |
| ·稳定合成PHB重组菌株的发酵 | 第71-72页 |
| ·PMtac启动子替换Ptac | 第72-73页 |
| ·DH5α-E ΔpoxB::(PMtac+phbCAB)菌株的发酵 | 第73-74页 |
| 3 讨论 | 第74-75页 |
| 4 本章小结 | 第75-76页 |
| 全文总结 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第84-85页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第85页 |
