| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-14页 |
| 前言 | 第14-28页 |
| 1.毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第14-24页 |
| ·Pichia pastoris表达系统发展简史 | 第14页 |
| ·外源蛋白在Pichia pastoris中的表达研究 | 第14-15页 |
| ·制约Pichia pastoris表达系统发展的因素及可能的解决办法 | 第15-24页 |
| 2.hBMP4和7研究概况 | 第24-26页 |
| 3.本研究的目的和意义 | 第26-28页 |
| 第一章 密码子使用对hBMP4和hBMP7表达量的影响 | 第28-56页 |
| 1.材料与方法: | 第28-35页 |
| ·菌株与质粒 | 第28页 |
| ·工具酶 | 第28页 |
| ·生化试剂 | 第28页 |
| ·表达载体pPIC9K-hBMP4,7-mat的构建 | 第28-29页 |
| ·表达载体pPIC9K-hBmp4,7-mut构建 | 第29-33页 |
| ·表达载体pPIC9-hBMP4-syn的构建 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的转化到Pichia pastoris宿主菌 | 第34页 |
| ·转化子的筛选 | 第34-35页 |
| ·hBMP4和hBMP7的分泌表达 | 第35页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第35页 |
| ·表达产物的Western Blotting分析 | 第35页 |
| 2 结果 | 第35-54页 |
| ·hBMP4,7成熟肽原序列在Pichia pastoris中的表达研究 | 第35-38页 |
| ·hBMP4和hBMP7成熟肽点突变序列在Pichia pastoris中的表达研究 | 第38-44页 |
| ·hBMP4成熟肽全序列优化对表达量的影响 | 第44-54页 |
| 3 讨论 | 第54-56页 |
| 第二章 多拷贝基因对hBMP7表达的影响 | 第56-62页 |
| 1.材料与方法 | 第56-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第56页 |
| ·主要试剂 | 第56-57页 |
| ·pAO815-hBMP7-1c表达载体的构建 | 第57页 |
| ·多拷贝重组表达质粒pAO815-hBMP7的构建 | 第57-58页 |
| 2 结果 | 第58-61页 |
| ·hBMP-7成熟肽的多拷贝表达载体的构建 | 第58-59页 |
| ·多拷贝hBMP-7成熟肽的分泌表达 | 第59-61页 |
| 3.讨论 | 第61-62页 |
| 第三章 培养条件对hBMP4表达量和糖基化的影响 | 第62-73页 |
| 1.材料与方法 | 第62-63页 |
| ·培养基 | 第62-63页 |
| ·Dot blotting相对定量分析 | 第63页 |
| ·hBMP4发酵罐发酵培养 | 第63页 |
| 2 结果 | 第63-71页 |
| ·菌体浓度对hBMP4表达的影响 | 第63-64页 |
| ·甲醇浓度对hBMP4表达的影响 | 第64-65页 |
| ·起始pH值对hBMP4表达的影响 | 第65页 |
| ·甲醇诱导周期对hBMP4表达量的影响 | 第65-66页 |
| ·装量对hBMP4表达量的影响 | 第66-67页 |
| ·培养基组成对hBMP4表达量的影响 | 第67页 |
| ·发酵罐培养对hBMP4表达的影响 | 第67-68页 |
| ·甲醇浓度对hBMP4糖基化的影响 | 第68-69页 |
| ·菌体浓度对hBMP4糖基化的影响 | 第69页 |
| ·培养温度对hBMP4糖基化的影响 | 第69-70页 |
| ·装量对hBMP4糖基化的影响 | 第70页 |
| ·培养基组成对hBMP4糖基化的影响 | 第70-71页 |
| 3.讨论 | 第71-73页 |
| 第四章 rhBMP4,7分离纯化和生理活性研究 | 第73-86页 |
| 1.材料与方法 | 第73-75页 |
| ·材料: | 第73页 |
| ·有关溶液的配制 | 第73页 |
| ·rhBMP7纯化 | 第73页 |
| ·rhBMP4纯化 | 第73-74页 |
| ·小鼠肌袋包埋法检测rhBMP4,7生理活性 | 第74页 |
| ·苏木精-伊红染色(HE) | 第74-75页 |
| ·碱性磷酸酶法检测rhBMP4活性 | 第75页 |
| 2 结果 | 第75-83页 |
| ·rhBMP4纯化结果 | 第75-78页 |
| ·rhBMP7纯化结果 | 第78页 |
| ·小鼠肌袋包埋法检测rhBMP4,7的生理活性 | 第78-80页 |
| ·碱性磷酸酶活性法检测rhBMP4的生理活性 | 第80-81页 |
| ·Pichia pastoris对rhBMP4和rhBMP7的修饰、加工 | 第81-83页 |
| 3.讨论 | 第83-86页 |
| 第五章 hBMP4和hBMP7全长序列在Pichia pastoris中的表达研究 | 第86-99页 |
| 1.材料与方法 | 第86-90页 |
| ·菌株与质粒 | 第86-87页 |
| ·表达质粒pPIC9K-hBMP4-pro-mat的构建 | 第87-88页 |
| ·表达质粒pPIC9K-hBMP4-pro-mut的构建 | 第88-89页 |
| ·表达质粒pPIC9K-hBMP7-pro-mat的构建 | 第89页 |
| ·表达质粒pPIC9K-hBMP7-pro-mut的构建 | 第89-90页 |
| 2 结果: | 第90-97页 |
| ·hBMP4全序列在Pichia pastoris中的表达 | 第90-94页 |
| ·hBMP7全序列在Pichia pastoris中的表达研究 | 第94-97页 |
| 3 讨论 | 第97-99页 |
| 结论 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-110页 |
| 附录 | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
