| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-10页 |
| 1 前言 | 第10-28页 |
| ·利用纤维素质原料生产乙醇 | 第10-23页 |
| ·利用纤维素质原料生成乙醇的原理 | 第10-11页 |
| ·纤维素酶 | 第11-17页 |
| ·纤维素酶降解机理 | 第11-12页 |
| ·产纤维素酶菌株的研究进展 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶基因的克隆 | 第13-14页 |
| ·重组纤维素酶的表达 | 第14-15页 |
| ·纤维素酶的活力测定 | 第15页 |
| ·纤维素酶的用途 | 第15-17页 |
| ·利用纤维素质材料酿造乙醇的工艺研究 | 第17-23页 |
| ·纤维素质材料的物质组成 | 第17页 |
| ·纤维素质物质材料的预处理 | 第17-20页 |
| ·酶解 | 第20页 |
| ·发酵工艺研究 | 第20-23页 |
| ·PICHIA PASTORIS 表达系统 | 第23-25页 |
| ·毕赤酵母表达系统的优特点 | 第23页 |
| ·P_（AOX1）表达系统 | 第23-24页 |
| ·P_（GAP）表达系统 | 第24-25页 |
| ·本研究的意义 | 第25-26页 |
| ·本研究技术路线 | 第26-28页 |
| ·Pichia pastoris 工程菌表达纤维素酶的技术路线 | 第26页 |
| ·纤维素酶系酿酒酵母载体构建的技术路线 | 第26-28页 |
| 2 材料与方法 | 第28-44页 |
| ·实验材料 | 第28-33页 |
| ·菌株和质粒 | 第28-29页 |
| ·分子生物学常用酶和试剂（盒） | 第29页 |
| ·常用培养基、试剂和缓冲液 | 第29-33页 |
| ·常用培养基配方 | 第29-30页 |
| ·常用试剂配方 | 第30-33页 |
| ·实验方法 | 第33-44页 |
| ·DNA 提取 | 第33-34页 |
| ·质粒DNA 的提取 | 第33页 |
| ·木霉基因组DNA 的提取 | 第33-34页 |
| ·引物设计 | 第34-36页 |
| ·扩增纤维素酶基因的引物 | 第34-35页 |
| ·扩增多克隆位点的引物 | 第35页 |
| ·扩增 G418 抗性基因的引物 | 第35页 |
| ·扩增酿酒酵母rDNA 基因的引物 | 第35-36页 |
| ·PCR 反应 | 第36页 |
| ·PCR 反应体系 | 第36页 |
| ·PCR 反应条件 | 第36页 |
| ·PCR 反应产物的检测 | 第36页 |
| ·PCR 产物及质粒DNA 酶切反应 | 第36-38页 |
| ·PCR 产物的沉淀回收 | 第36页 |
| ·PCR 产物及质粒DNA 的单酶切 | 第36-37页 |
| ·PCR 产物及质粒DNA 的双酶切 | 第37-38页 |
| ·DNA 酶切产物的回收 | 第38-39页 |
| ·DNA 分子的连接 | 第39页 |
| ·PCR 回收产物与T 载体连接 | 第39页 |
| ·目的片段与载体酶切后的连接 | 第39页 |
| ·连接产物转化E.coli DH5α | 第39-40页 |
| ·E. coliDH5α感受态细胞的制备 | 第39页 |
| ·连接产物转化 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的提取 | 第40页 |
| ·重组子的酶切鉴定 | 第40页 |
| ·阳性克隆的测序 | 第40页 |
| ·酵母转化 | 第40-41页 |
| ·电转化感受态的制作 | 第40页 |
| ·重组质粒线性化 | 第40-41页 |
| ·电转化 | 第41页 |
| ·高拷贝转化子的筛选 | 第41页 |
| ·SDS-PAGE | 第41-42页 |
| ·发酵产物的酶活测定 | 第42-44页 |
| ·发酵产物的去离子 | 第42页 |
| ·葡萄糖标准曲线的制作 | 第42页 |
| ·CMC 酶活力的测定 | 第42-44页 |
| 3 结果与分析 | 第44-59页 |
| ·纤维素酶基因克隆 | 第44-48页 |
| ·里氏木霉基因组DNA 的提取 | 第44页 |
| ·BGⅠ基因的克隆 | 第44-45页 |
| ·CBHⅡ基因的克隆 | 第45-47页 |
| ·EGⅡ基因的克隆 | 第47-48页 |
| ·多克隆位点、G418 抗性基因及酿酒酵母RDNA 基因的克隆 | 第48-50页 |
| ·多克隆位点的获得 | 第48页 |
| ·G418 抗性基因的PCR 扩增和测序 | 第48-49页 |
| ·酿酒酵母rDNA 基因的 PCR 扩增和测序 | 第49-50页 |
| ·含纤维素酶基因的 PICHIA PASTORIS 表达载体构建 | 第50-53页 |
| ·pPIC9K-BG、pPIC9K-CBH、pPIC9K-EG 的构建 | 第50-52页 |
| ·pGAP9K-BG、pGAP9K-CBH、pG AP9K-EG 的构建 | 第52-53页 |
| ·pGAP9K 的构建 | 第52页 |
| ·pGAP9K-BG、pGAP9K-CBH、pG AP9K-EG 的构建 | 第52-53页 |
| ·含纤维二糖水解酶基因的 PICHIA PASTORIS 工程菌构建 | 第53-54页 |
| ·CBHⅡ基因转化毕节酵母 G5115 | 第53-54页 |
| ·在G418 平板上筛选高拷贝整合cbh2 的重组转化子 | 第54页 |
| ·在生物反应器中发酵 PICHIA PASTORIS 工程菌生产重组CBHⅡ | 第54-55页 |
| ·重组纤维素酶活力测定 | 第55-56页 |
| ·反应体系中吸光度与葡萄糖含量的标准曲线 | 第55页 |
| ·发酵液的酶活力 | 第55-56页 |
| ·含纤维素酶系酿酒酵母表达载体构建 | 第56-59页 |
| ·载体构建的流程图 | 第56页 |
| ·载体构建过程中的鉴定 | 第56-59页 |
| 4 讨论 | 第59-62页 |
| ·关于材料的选择 | 第59页 |
| ·关于外显子拼接法扩增目的基因 | 第59-60页 |
| ·关于重组纤维素酶生产 | 第60页 |
| ·关于载体的构建 | 第60-61页 |
| ·关于用 G418 筛选高拷贝重组子 | 第61-62页 |
| 5 总结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 附录：缩写词（ABBREVIATION） | 第70-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
