| 中文摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-36页 |
| 1 引言 | 第15-16页 |
| 2 类固醇化合物 | 第16-20页 |
| ·类固醇种类及其生物功能 | 第16-18页 |
| ·固醇类 | 第17页 |
| ·胆汁酸和胆汁醇 | 第17-18页 |
| ·类固醇激素 | 第18页 |
| ·类固醇激素在环境中的迁移转化 | 第18-20页 |
| ·吸附 | 第18-19页 |
| ·生物降解 | 第19页 |
| ·光降解 | 第19-20页 |
| 3 微生物对甾体的转化 | 第20-22页 |
| ·微生物对甾体转化的反应机理 | 第20-22页 |
| ·微生物羟化的专一性 | 第20-21页 |
| ·脱氢反应的机理 | 第21页 |
| ·微生物对甾醇侧链的降解途径 | 第21-22页 |
| ·微生物对甾体母核的降解 | 第22页 |
| ·影响转化的一般因素 | 第22页 |
| ·物理因素 | 第22页 |
| ·培养基组成 | 第22页 |
| 4 睾丸酮丛毛单胞菌研究进展 | 第22-30页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌类固醇代谢途径 | 第23-24页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌类固醇代谢基因簇 | 第24-27页 |
| ·tesB | 第24-25页 |
| ·tesDEFG | 第25页 |
| ·tesHI | 第25-26页 |
| ·tesA1A2 | 第26页 |
| ·tesR | 第26-27页 |
| ·其它基因 | 第27页 |
| ·类固醇对睾丸酮丛毛单胞菌降解酶的诱导表达 | 第27页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌关键酶 3a-HSD/CR 表达调控 | 第27-30页 |
| 5 代谢工程在细菌定向调控中的应用 | 第30-33页 |
| ·在现存途径中提高代谢物质的流量 | 第30-32页 |
| ·增加限速步骤酶编码基因的拷贝数 | 第30页 |
| ·改变分支代谢途径的流向 | 第30-31页 |
| ·强化以启动子为主的关键基因表达系统 | 第31页 |
| ·提高途径激活因子的合成速率 | 第31页 |
| ·灭活途径抑制因子的编码基因 | 第31-32页 |
| ·扩展代谢途径 | 第32页 |
| ·转移或构建新的代谢途径 | 第32-33页 |
| ·转移代谢途径 | 第32页 |
| ·构建新的代谢途径 | 第32-33页 |
| ·逆代谢工程 | 第33页 |
| 6 存在问题、本研究的意义及主要研究内容 | 第33-36页 |
| 第二章 睾丸酮丛毛单胞菌 teiR 基因克隆及在大肠杆 菌中的表达 | 第36-71页 |
| 1 材料与方法 | 第36-47页 |
| ·材料 | 第36-37页 |
| ·菌株与质粒 | 第36页 |
| ·培养基 | 第36-37页 |
| ·酶、生化试剂及试剂盒 | 第37页 |
| ·ELISA 相关材料 | 第37页 |
| ·主要仪器设备 | 第37页 |
| ·方法 | 第37-47页 |
| ·细菌培养 | 第37页 |
| ·细菌基因组DNA 的提取 | 第37-38页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌目的片断的PCR 扩增 | 第38-39页 |
| ·目的片断PCR 扩增产物的胶回收 | 第39页 |
| ·目的序列测序及生物信息学分析 | 第39页 |
| ·质粒转化大肠杆菌 | 第39-41页 |
| ·表达载体pET28a-teiR 的构建 | 第41-42页 |
| ·TeiR 融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第42-43页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第43-44页 |
| ·质粒载体pKteiR100、pKtac2-teiR、pKteiRC、pKtac2-teiRC、pKteiRN和pKtac2-teiRN 的构建 | 第44-46页 |
| ·重组质粒单独或与p6 共转化大肠杆菌 | 第46页 |
| ·细菌总蛋白提取 | 第46页 |
| ·细菌蛋白定量 | 第46-47页 |
| ·ELISA 检测 | 第47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-68页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌 teiR 基因克隆及功能生物信息学预测 | 第47-54页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌teiR 基因PCR 扩增 | 第47-48页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌teiR 基因核苷酸序列分析 | 第48-50页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌teiR 基因编码蛋白的结构及功能预测 | 第50-54页 |
| ·TeiR 融合蛋白分离纯化及多克隆抗体的制备 | 第54-57页 |
| ·表达载体pET28a-teiR 的构建 | 第54-55页 |
| ·TeiR 融合蛋白的诱导表达 | 第55-56页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第56页 |
| ·多克隆抗体的效价分析 | 第56-57页 |
| ·teiR 基因亚克隆及在大肠杆菌中的表达 | 第57-68页 |
| ·质粒载体pKteiR100 和pKtac2-teiR 的构建 | 第57-60页 |
| ·质粒载体pKteiRC、pKtac2-teiRC、pKteiRN 和pKtac2-teiRN 的构建 | 第60-61页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌的基因表达量检测 | 第61-68页 |
| 3 小结与讨论 | 第68-71页 |
| 第三章 睾丸酮丛毛单胞菌 teiR 基因插入失活突变体 和高效表达菌的构建及其降解特性分析 | 第71-126页 |
| 1 材料与方法 | 第71-90页 |
| ·材料 | 第71-72页 |
| ·菌株与质粒 | 第71页 |
| ·培养基 | 第71页 |
| ·酶、生化试剂及试剂盒 | 第71页 |
| ·ELISA 药品 | 第71-72页 |
| ·双向电泳药品 | 第72页 |
| ·荧光定量相关药品 | 第72页 |
| ·仪器设备 | 第72页 |
| ·方法 | 第72-90页 |
| ·细菌培养 | 第72页 |
| ·分子生物学操作 | 第72页 |
| ·插入失活突变体同源重组打靶载体的构建 | 第72-73页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌teiR 基因插入失活突变体的构建 | 第73-74页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌teiR 基因高效表达菌的构建 | 第74页 |
| ·PCR 筛选teiR 基因高效表达菌 | 第74-75页 |
| ·Southern blot | 第75-77页 |
| ·插入失活突变体和高效表达菌生长曲线绘制 | 第77-78页 |
| ·高效表达菌RNA 提取及cDNA 第一链的合成 | 第78-79页 |
| ·荧光定量PCR 检测高效表达菌teiR 和3a-HSD/CR 基因表达 | 第79-82页 |
| ·高效表达菌降解酶基因的RT-PCR 检测 | 第82-83页 |
| ·高效表达菌和插入失活突变体TeiR 和3a-HSD/CR 的蛋白表达 | 第83-84页 |
| ·高效表达菌蛋白质双向电泳 | 第84-88页 |
| ·连续传代培养的TeiR 及3a-HSD/CR 表达检测 | 第88页 |
| ·HPLC 测定插入失活突变体和高效表达菌对睾丸酮的降解能力 | 第88-89页 |
| ·高效表达菌对土壤中甾体化合物的降解 | 第89-90页 |
| 2 结果与分析 | 第90-120页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌 teiR 基因插入失活突变体的构建及降解特 性分析 | 第90-96页 |
| ·插入失活突变体同源重组打靶载体的构建 | 第90页 |
| ·teiR 基因插入失活突变体的构建 | 第90-91页 |
| ·突变体TeiR 蛋白的表达水平检测 | 第91-92页 |
| ·突变体关键酶3a-HSD/CR 的表达水平检测 | 第92-93页 |
| ·突变体生长曲线 | 第93-94页 |
| ·睾丸酮高效液相检测条件的确立 | 第94-95页 |
| ·插入失活突变体对睾丸酮的降解特性 | 第95-96页 |
| ·睾丸酮丛毛单胞菌 teiR 基因高效表达菌的构建及降解特性分 析 | 第96-120页 |
| ·高效表达菌的PCR 筛选 | 第96-97页 |
| ·高效表达菌的Southern blot 检测 | 第97-98页 |
| ·高效表达菌不同培养条件下的生长曲线测定 | 第98-99页 |
| ·高效表达菌总RNA 提取 | 第99-100页 |
| ·荧光定量PCR 检测teiR 基因的表达量 | 第100-103页 |
| ·荧光定量PCR 检测3a-HSD/CR 基因的表达量 | 第103-106页 |
| ·高效表达菌的已知降解相关基因的RT-PCR 检测 | 第106-107页 |
| ·高效表达菌的TeiR 蛋白表达水平检测 | 第107-109页 |
| ·高效表达菌的3a-HSD/CR 蛋白表达水平检测 | 第109-110页 |
| ·蛋白质双向电泳 | 第110-115页 |
| ·连续传代培养的3a-HSD/CR 及TeiR 表达量检测 | 第115-118页 |
| ·HPLC 检测高效表达菌对睾丸酮的降解 | 第118-119页 |
| ·高效表达菌对养鸡场土壤中甾体化合物的降解 | 第119-120页 |
| 3 小结与讨论 | 第120-126页 |
| 第四章 本研究的主要结论、创新点及研究展望 | 第126-128页 |
| 1 主要结论 | 第126-127页 |
| 2 本研究的主要创新点 | 第127页 |
| 3 进一步研究展望 | 第127-128页 |
| 参考文献 | 第128-138页 |
| 附录Ⅰ试验所用部分试剂配方 | 第138-141页 |
| 附录Ⅱ缩写词和英汉对照 | 第141-143页 |
| 附录Ⅲ在学期间发表的文章 | 第143-144页 |
| 致谢 | 第144页 |
