| 缩略词表 | 第1-9页 |
| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-33页 |
| 1 从反义RNA到人工miRNA的植物基因沉默技术革新 | 第12-24页 |
| ·基因沉默的发现与第一代基因沉默技术 | 第13-16页 |
| ·microRNA的发现与人工microRNA技术 | 第16-21页 |
| ·人工ta-siRNA技术 | 第21-22页 |
| ·下一代基因沉默技术 | 第22-23页 |
| ·展望 | 第23-24页 |
| 2 植物抗病毒基因工程 | 第24-27页 |
| ·蛋白质介导的病毒抗性 | 第24-25页 |
| ·RNA介导的病毒抗性 | 第25-26页 |
| ·微卫星RNA介导的病毒抗性 | 第26页 |
| ·非病毒来源的抗性 | 第26-27页 |
| 3 microRNA与植物发育 | 第27-29页 |
| ·microRNA与分生组织 | 第27-28页 |
| ·microRNA调控叶片发育 | 第28页 |
| ·microRNA与根的发育 | 第28页 |
| ·microRNA与花器官的发育 | 第28-29页 |
| ·microRNA与花期 | 第29页 |
| 4 microRNA与植物逆境应答 | 第29-31页 |
| ·microRNA与过氧化物的清除 | 第29-30页 |
| ·microRNA与干旱逆境 | 第30页 |
| ·microRNA调控矿物营养平衡 | 第30-31页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第31-33页 |
| 第二章 利用人工miRNA培育抗病毒番茄 | 第33-75页 |
| 1 前言 | 第33-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-43页 |
| ·植物和病毒材料 | 第35页 |
| ·菌株和质粒 | 第35页 |
| ·人工miRNA植物表达载体的构建 | 第35-36页 |
| ·GFP-Target报告基因表达载体的构建 | 第36页 |
| ·番茄的遗传转化 | 第36-37页 |
| ·转基因植株的PCR检测 | 第37-38页 |
| ·Southern杂交 | 第38页 |
| ·RNA提取和Northern杂交 | 第38-39页 |
| ·内源疑似靶基因以及病毒RNA的RT-PCR分析 | 第39-41页 |
| ·TYLCV的PCR检测 | 第41页 |
| ·嫁接 | 第41-42页 |
| ·病毒接种 | 第42页 |
| ·ELISA检测CMV病毒的积累 | 第42-43页 |
| ·农杆菌渗入烟草叶片瞬时表达以及GFP荧光检测 | 第43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-69页 |
| ·靶位点的选择 | 第43-46页 |
| ·人工miRNA植物表达载体的构建 | 第46-51页 |
| ·人工miRNA的干涉功能检测 | 第51-54页 |
| ·转基因番茄的获得和分子检测 | 第54-56页 |
| ·转基因植物的CMV抗性检测 | 第56-60页 |
| ·嫁接接种检测人工miRNA对病毒的持久抗性 | 第60-62页 |
| ·人工miRNA对植物的保护是细胞自主性的 | 第62-63页 |
| ·多种病毒复合侵染情况下人工miRNA对植物的保护能力 | 第63-66页 |
| ·人工miRNA的靶标特异性 | 第66-67页 |
| ·转基因株系在CMV感染和正常生长状况下的果实大小和产量分析 | 第67-69页 |
| 4 讨论 | 第69-75页 |
| ·同时敲出多个基因产生更高的抗病效率 | 第69页 |
| ·针对3’UTR保守区产生广谱抗性 | 第69页 |
| ·amiR-2a/b阻遏病毒侵染途径的多个步骤 | 第69-71页 |
| ·靶向3'UTR与靶向编码区的人工miRNA可能具有不同的抗病毒途径 | 第71-72页 |
| ·人工miRNA在植物中细胞自主性作用方式的理论与现实意义 | 第72-73页 |
| ·人工miRNA抗病毒功能不受非目标病毒入侵的影响是一个重要优势 | 第73-74页 |
| ·人工miRNA可以避免脱靶现象 | 第74-75页 |
| 第三章 超表达sly-miR169提高番茄植株耐旱性 | 第75-93页 |
| 1 前言 | 第75-76页 |
| 2 材料与方法 | 第76-80页 |
| ·植物材料与栽培条件 | 第76页 |
| ·植物表达载体的构建与番茄的遗传转化 | 第76页 |
| ·RNA抽提与Northern杂交 | 第76页 |
| ·半定量RT-PCR | 第76-77页 |
| ·Real-time RT-PCR | 第77页 |
| ·干旱处理 | 第77-78页 |
| ·气孔开度测量 | 第78页 |
| ·气孔导度和蒸腾速率的测定 | 第78页 |
| ·离体叶片失水率测定 | 第78页 |
| ·离体枝条吸水速率测量 | 第78-79页 |
| ·NaCl处理下发芽实验 | 第79页 |
| ·生物信息学分析 | 第79页 |
| ·数据处理 | 第79-80页 |
| 3 结果与分析 | 第80-90页 |
| ·番茄中的miR169家族及其靶基因 | 第80页 |
| ·Sly-miR169靶基因的组织表达谱 | 第80-81页 |
| ·干旱处理时Sly-miR169的表达上升而靶基因的表达下降 | 第81-83页 |
| ·在番茄中超表达Sly-miR169可以降低SlNF-YA1/2/3和SlMRP1的RNA积累 | 第83-87页 |
| ·转基因植株抗旱性增强 | 第87页 |
| ·转基因植株气孔开度缩小蒸腾速度降低 | 第87-89页 |
| ·转基因植株对盐处理更敏感 | 第89-90页 |
| ·MRP1是miR169的一个古老但处于演化中的靶基因 | 第90页 |
| 4 讨论 | 第90-93页 |
| ·35S-miR169番茄可能由于保卫细胞离子运输降低影响气孔运动 | 第90-92页 |
| ·通过调控sly-miR169提高植物水分利用率的可能性 | 第92-93页 |
| 第四章 Sly-miR156调控番茄生长发育 | 第93-112页 |
| 1 前言 | 第93-94页 |
| 2 材料与方法 | 第94-97页 |
| ·植物材料与栽培环境 | 第94页 |
| ·载体构建与植物的遗传转化 | 第94-95页 |
| ·RNA抽提和Northern杂交 | 第95页 |
| ·半定量RT-PCR和real-time RT-PCR | 第95页 |
| ·生物信息学分析和数据处理 | 第95-97页 |
| 3 结果与分析 | 第97-109页 |
| ·Sly-miR156及其靶基因 | 第97-101页 |
| ·MiR156在番茄中的组织表达谱并在番茄中超量表达sly-miR156a | 第101-104页 |
| ·超表达sly-miR156a的番茄植株产生多种生长发育和生殖发育上的表型变化 | 第104-106页 |
| ·靶基因在野生型和转基因番茄中的表达谱 | 第106-108页 |
| ·转基因植物中SFT基因的表达下降 | 第108-109页 |
| 4 讨论 | 第109-112页 |
| ·miRNA156在调节植物发育过程中功能的保守性和物种特异性 | 第109页 |
| ·miR156可能通过调控SFT控制花序结构和开花时间 | 第109-110页 |
| ·Sly-miR156与番茄果实成熟 | 第110页 |
| ·Sly-miR156与番茄果实大小和产量 | 第110-111页 |
| ·Sly-miR156与髓的发育和气生根的形成 | 第111页 |
| ·Sly-miR156的分子调控和环境影响 | 第111-112页 |
| 结语 | 第112-114页 |
| 参考文献 | 第114-130页 |
| 附录 | 第130-132页 |
| 致谢 | 第132页 |
