| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略表 | 第11-12页 |
| 1.前言 | 第12-27页 |
| 1.1 研究背景 | 第12-15页 |
| 1.1.1 基因组编辑技术的发展趋势 | 第12-14页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas9系统的应用及其局限性 | 第14-15页 |
| 1.2 CRISPR的研究进展 | 第15-19页 |
| 1.2.1 CRISPR简介 | 第15-17页 |
| 1.2.2 CRISPR的分类 | 第17-18页 |
| 1.2.3 CRISPR的发展 | 第18-19页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9n研究进展 | 第19-23页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9n的工作原理 | 第19-21页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9n系统的应用 | 第21-23页 |
| 1.4 芽胞杆菌蛋白酶对外源蛋白表达的影响 | 第23-25页 |
| 1.4.1 芽胞杆菌蛋白酶简介 | 第23页 |
| 1.4.2 芽胞杆菌胞内蛋白酶对异源蛋白表达的影响 | 第23-24页 |
| 1.4.3 芽胞杆菌胞外蛋白酶对异源蛋白表达的影响 | 第24页 |
| 1.4.4 外源蛋白在芽胞杆菌中的表达 | 第24-25页 |
| 1.5 研究的目的与意义 | 第25-27页 |
| 2.材料与方法 | 第27-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-43页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第27-31页 |
| 2.1.2 PCR引物 | 第31-41页 |
| 2.1.3 培养基、抗生素使用浓度和培养条件 | 第41页 |
| 2.1.4 工具酶及试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.5 抽提液和缓冲液 | 第42页 |
| 2.1.6 实验仪器 | 第42-43页 |
| 2.2 实验方法 | 第43-51页 |
| 2.2.1 分子生物学方法 | 第43-45页 |
| 2.2.2 Cas9n游离表达质粒的构建 | 第45页 |
| 2.2.3 pCas9n质粒在地衣芽胞杆菌DW2中的表达 | 第45页 |
| 2.2.4 SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| 2.2.5 地衣芽胞杆菌温敏型整合质粒的构建 | 第46-47页 |
| 2.2.6 大肠杆菌质粒转化 | 第47-49页 |
| 2.2.7 地衣芽胞杆菌双交换突变体的获得 | 第49页 |
| 2.2.8 工程菌株中质粒的消除 | 第49页 |
| 2.2.9 纳豆激酶酶活测定方法 | 第49-50页 |
| 2.2.10 实验数据处理方法 | 第50-51页 |
| 3.结果与分析 | 第51-69页 |
| 3.1 Cas9n蛋白在地衣芽胞杆菌中的游离表达与整合 | 第51-55页 |
| 3.1.1 Cas9n蛋白在地衣芽胞杆菌中的游离表达 | 第51-53页 |
| 3.1.2 Cas9n基因整合菌株的构建 | 第53-55页 |
| 3.2 CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌中的应用策略研究 | 第55-64页 |
| 3.2.1 单基因敲除策略 | 第55-58页 |
| 3.2.2 双基因同时敲除策略 | 第58-59页 |
| 3.2.3 大片段DNA敲除策略 | 第59-62页 |
| 3.2.4 单基因整合策略 | 第62-63页 |
| 3.2.5 基因组编辑效率评估 | 第63-64页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9n系统的应用 | 第64-69页 |
| 3.3.1 胞内蛋白酶基因敲除菌株的构建及纳豆激酶发酵 | 第64-65页 |
| 3.3.2 胞外蛋白酶基因敲除菌株的构建及纳豆激酶发酵 | 第65-66页 |
| 3.3.3 高产纳豆激酶宿主菌株的构建 | 第66-68页 |
| 3.3.4 工程菌株纳豆激酶发酵实验 | 第68-69页 |
| 4.讨论与展望 | 第69-74页 |
| 4.1 结果 | 第69-70页 |
| 4.2 讨论 | 第70-72页 |
| 4.3 展望 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 硕士期间发表论文 | 第83页 |
