| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-34页 |
| 1.1 三七的化学成分 | 第17-19页 |
| 1.1.1 皂苷成分 | 第17-18页 |
| 1.1.2 黄酮类 | 第18页 |
| 1.1.3 三七素 | 第18-19页 |
| 1.1.4 甾醇 | 第19页 |
| 1.1.5 三七多糖 | 第19页 |
| 1.1.6 氨基酸成分 | 第19页 |
| 1.1.7 无机成分 | 第19页 |
| 1.2 三七的药理作用 | 第19-23页 |
| 1.2.1 对心脑血管系统的影响 | 第20-21页 |
| 1.2.1.1 抗心律失常 | 第20页 |
| 1.2.1.2 防止动脉粥样硬化 | 第20页 |
| 1.2.1.3 降血压 | 第20页 |
| 1.2.1.4 抗休克 | 第20-21页 |
| 1.2.2 在肿瘤防治中的作用 | 第21页 |
| 1.2.3 对肝脏的作用 | 第21-22页 |
| 1.2.3.1 保肝作用 | 第21页 |
| 1.2.3.2 抗肝脏纤维化作用 | 第21-22页 |
| 1.2.4 对免疫系统的影响 | 第22页 |
| 1.2.5 对物质代谢的作用 | 第22-23页 |
| 1.2.6 其他作用 | 第23页 |
| 1.3 三七皂苷的生物合成及关键酶 | 第23-25页 |
| 1.4 萜类和聚酮类物质组合生物合成及应用 | 第25-32页 |
| 1.4.1 组合生物合成的定义 | 第26页 |
| 1.4.2 萜类物质的组合生物合成 | 第26-30页 |
| 1.4.2.1 青蒿素的组合生物合成 | 第26页 |
| 1.4.2.2 利用人工构建大肠杆菌产生青蒿素 | 第26-27页 |
| 1.4.2.3 利用酵母工程菌产生青蒿素 | 第27页 |
| 1.4.2.4 紫杉醇的组合生物合成 | 第27页 |
| 1.4.2.5 利用人工构建大肠杆菌产生紫杉烯 | 第27-29页 |
| 1.4.2.6 利用酵母工程菌产生紫杉烯 | 第29-30页 |
| 1.4.3 聚酮类物质的组合生物合成 | 第30-32页 |
| 1.4.3.1 黄烷酮和二苯乙烯类产物 | 第30-31页 |
| 1.4.3.2 非天然黄烷酮类和二苯乙烯类产物 | 第31页 |
| 1.4.3.3 黄酮和黄酮醇类产物 | 第31-32页 |
| 1.4.3.4 二苯乙烯一甲醚类产物 | 第32页 |
| 1.5 本研究的目的及意义 | 第32-33页 |
| 1.6 实验技术路线 | 第33-34页 |
| 第二章 三七细胞SS基因的克隆与超表达载体的构建 | 第34-53页 |
| 2.1 前言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料与试剂 | 第35-37页 |
| 2.2.1 植物材料 | 第35页 |
| 2.2.2 菌株和载体 | 第35-36页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第36页 |
| 2.2.4 缓冲液和培养基 | 第36-37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-44页 |
| 2.3.1 三七总RNA的提取及纯化 | 第37-38页 |
| 2.3.2 SS基因的获得 | 第38-40页 |
| 2.3.2.1 cDNA的合成 | 第38页 |
| 2.3.2.2 SS基因的扩增 | 第38-39页 |
| 2.3.2.3 PCR产物胶回收 | 第39-40页 |
| 2.3.3 克隆载体的构建 | 第40页 |
| 2.3.4 转化大肠杆菌感受态细胞 | 第40页 |
| 2.3.5 pGEM-T-SS质粒的提取 | 第40-41页 |
| 2.3.6 pGEM-T-SS质粒双酶切 | 第41-42页 |
| 2.3.7 pCAMBIA1300S质粒双酶切 | 第42-43页 |
| 2.3.7.1 pCAMBIA1300S质粒第一次单酶切 | 第42页 |
| 2.3.7.2 乙醇沉淀回收酶切产物 | 第42页 |
| 2.3.7.3 pCAMBIA1300S质粒第二次单酶切 | 第42-43页 |
| 2.3.8 酶切产物胶回收 | 第43页 |
| 2.3.9 连接反应 | 第43页 |
| 2.3.10 转化大肠杆菌感受态细胞 | 第43页 |
| 2.3.11 pCAMBIA1300S-SS重组质粒的筛选和检测 | 第43-44页 |
| 2.4 结果与分析 | 第44-51页 |
| 2.4.1 三七总RNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.4.2 SS基因RT-PCR | 第45-46页 |
| 2.4.3 SS基因胶回收 | 第46页 |
| 2.4.4 SS基因克隆载体的构建 | 第46-47页 |
| 2.4.5 提取pGEM-T-SS和pCAMBIA1300S质粒 | 第47-48页 |
| 2.4.6 pGEM-T-SS和pCAMBIA1300S质粒双酶切 | 第48-49页 |
| 2.4.7 pGEM-T-SS和pCAMBIA1300S质粒双酶切后胶回收 | 第49页 |
| 2.4.8 pCAMBIA1300S-SS重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 2.4.9 双酶切检测 | 第50-51页 |
| 2.5 讨论 | 第51-53页 |
| 第三章 根癌农杆菌介导的遗传转化及转基因细胞的筛选 | 第53-73页 |
| 3.1 前言 | 第53-54页 |
| 3.2 材料和试剂 | 第54-55页 |
| 3.2.1 植物材料 | 第54页 |
| 3.2.2 菌种 | 第54页 |
| 3.2.3 试剂和仪器 | 第54页 |
| 3.2.4 缓冲液和培养基 | 第54-55页 |
| 3.3 实验方法 | 第55-60页 |
| 3.3.1 pCAMBIA1300S-SS质粒提取 | 第55页 |
| 3.3.2 制备根癌农杆菌感受态细胞 | 第55-56页 |
| 3.3.3 CaCl_2冻融法转化农杆菌感受态细胞 | 第56页 |
| 3.3.4 超表达载体转化农杆菌的菌液PCR检测 | 第56-57页 |
| 3.3.5 阳性农杆菌的活化 | 第57页 |
| 3.3.6 农杆菌介导的三七遗传转化 | 第57-58页 |
| 3.3.7 CTAB法提取转基因三七细胞基因组DNA | 第58页 |
| 3.3.8 转基因细胞系的PCR检测 | 第58-59页 |
| 3.3.9 阳性转基因细胞系荧光定量PCR检测 | 第59-60页 |
| 3.4 结果与分析 | 第60-70页 |
| 3.4.1 pCAMBIA1300S-SS超表达载体转化根癌农杆菌 | 第60-62页 |
| 3.4.2 转基因三七细胞的PCR检测 | 第62-63页 |
| 3.4.3 转基因三七细胞荧光定量PCR检测 | 第63-70页 |
| 3.4.3.1 转基因三七细胞总RNA提取 | 第63-64页 |
| 3.4.3.2 RT-PCR检测 | 第64-65页 |
| 3.4.3.3 实时荧光半定量PCR检测 | 第65-68页 |
| 3.4.3.4 SS、DS基因相对定量实验结果 | 第68-70页 |
| 3.5 讨论 | 第70-73页 |
| 第四章 转基因三七细胞次级代谢物含量测定 | 第73-82页 |
| 4.1 前言 | 第73页 |
| 4.2 材料和试剂 | 第73-74页 |
| 4.2.1 植物材料 | 第73页 |
| 4.2.2 试剂和仪器 | 第73-74页 |
| 4.3 实验方法 | 第74-77页 |
| 4.3.1 三七细胞中总皂苷含量检测 | 第74-75页 |
| 4.3.1.1 标准曲线的制备 | 第74页 |
| 4.3.1.2 细胞干重测定 | 第74页 |
| 4.3.1.3 三七皂苷的粗提、纯化及含量测定 | 第74-75页 |
| 4.3.2 三七细胞中单体皂苷含量的测定 | 第75-77页 |
| 4.4 实验结果和分析 | 第77-80页 |
| 4.4.1 三七细胞中总皂苷含量的测定 | 第77-79页 |
| 4.4.2 三七细胞中单体皂苷含量的测定 | 第79-80页 |
| 4.5 讨论 | 第80-82页 |
| 第五章 结论和展望 | 第82-85页 |
| 5.1 结论 | 第82-83页 |
| 5.2 展望 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-93页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表文章目录 | 第93页 |
