| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 综述 | 第13-32页 |
| 1 生物质能的概述 | 第13-16页 |
| 1.1 生物质能 | 第13-14页 |
| 1.2 国内外对生物质能的研究和应用概况 | 第14-15页 |
| 1.3 发展生物质能的意义 | 第15-16页 |
| 1.3.1 经济意义 | 第15页 |
| 1.3.2 社会意义 | 第15页 |
| 1.3.3 环境保护意义 | 第15-16页 |
| 2 木聚糖酶概述 | 第16-28页 |
| 2.1 半纤维素与木聚糖 | 第16-17页 |
| 2.2 木聚糖酶的分类 | 第17-19页 |
| 2.3 木聚糖酶的结构功能特性 | 第19-20页 |
| 2.3.1 催化区结构域(Catalytic Domain,CD) | 第19页 |
| 2.3.2 纤维素结合域(Cellulose. Binding Domain,CBD) | 第19-20页 |
| 2.3.3 木聚糖结合区(Xylan. Binding Domain,XBD) | 第20页 |
| 2.3.4 连接序列(Linker sequence) | 第20页 |
| 2.3.5 热稳定区(Thermostabilising Domain) | 第20页 |
| 2.3.6 其它未知功能区域 | 第20页 |
| 2.4 聚糖酶催化的分子机制 | 第20-21页 |
| 2.5 木聚糖酶特性 | 第21-22页 |
| 2.6 耐热木聚糖酶 | 第22-24页 |
| 2.7 木聚糖酶在工业上的应用 | 第24-28页 |
| 2.7.1 木聚糖酶在造纸工业上的应用 | 第24-25页 |
| 2.7.2 木聚糖酶在食品行业上的应用 | 第25页 |
| 2.7.3 木聚糖酶在饲料工业上的应用 | 第25-26页 |
| 2.7.4 木聚糖酶在能源行业上的应用 | 第26页 |
| 2.7.5 木聚糖酶在其他行业上的应用 | 第26-28页 |
| 3 木聚糖酶的基因工程 | 第28-31页 |
| 3.1 木聚糖酶在细菌(大肠杆菌或者原核)表达 | 第28-29页 |
| 3.2 木聚糖酶在真菌(毕赤酵母或真核)表达 | 第29-30页 |
| 3.3 木聚糖酶在其他系统中表达 | 第30-31页 |
| 4 本研究的目的意义和研究内容 | 第31-32页 |
| 第二章 PPIC9K-XynA重组质粒的构建 | 第32-46页 |
| 1 实验材料 | 第32-34页 |
| 1.1 样品和载体 | 第32页 |
| 1.2 引物 | 第32页 |
| 1.3 主要分析软件 | 第32页 |
| 1.4 主要试剂 | 第32-33页 |
| 1.5 主要溶液和主要培养基 | 第33-34页 |
| 1.6 主要仪器 | 第34页 |
| 2 实验方法 | 第34-38页 |
| 2.1 pPIC9K载体的提取 | 第34-35页 |
| 2.2 XynA基因的克隆 | 第35-36页 |
| 2.3 pPIC9K-XynA重组质粒的构建 | 第36-37页 |
| 2.4 pPIC9K-XynA重组质粒在E.coli DH5α中的复制和验证 | 第37-38页 |
| 2.4.1 感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 2.4.2 转化反应 | 第37-38页 |
| 2.4.3 pPIC9K-XynA重组质粒的验证 | 第38页 |
| 3 结果与分析 | 第38-44页 |
| 3.1 pPIC9K载体 | 第38-39页 |
| 3.2 木聚糖酶XynA基因的克隆 | 第39-42页 |
| 3.2.1 木聚糖酶XynA基因的序列 | 第39-40页 |
| 3.2.2 木聚糖酶信号肽 | 第40-41页 |
| 3.2.3 木聚糖酶XynA基因上的没有酶切位点 | 第41页 |
| 3.2.4 pPIC9K载体克隆位点 | 第41页 |
| 3.2.5 引物的设计 | 第41-42页 |
| 3.3 pPIC9K-XynA重组质粒的构建 | 第42-44页 |
| 3.3.1 木聚糖酶XynA基因 | 第42-43页 |
| 3.3.2 pPIC9K和XynA双酶切 | 第43-44页 |
| 3.3.3 pPIC9K-XynA重组质粒及其双酶切验证 | 第44页 |
| 4 小结 | 第44-46页 |
| 第三章 木聚糖酶基因XynA在毕赤酵母中的表达 | 第46-57页 |
| 1 实验材料 | 第46-47页 |
| 1.1 样品和载体 | 第46页 |
| 1.2 主要试剂 | 第46页 |
| 1.3 实验仪器 | 第46页 |
| 1.4 主要溶液 | 第46-47页 |
| 1.5 主要培养基 | 第47页 |
| 1.5.1 各种母液的配制 | 第47页 |
| 1.5.2 各种培养基的配制 | 第47页 |
| 2 实验方法 | 第47-50页 |
| 2.1 pPIC9K-XynA重组质粒的线性化 | 第47-48页 |
| 2.2 毕赤酵母电转化方法 | 第48页 |
| 2.2.1 菌体的准备 | 第48页 |
| 2.2.2 电击转化 | 第48页 |
| 2.3 阳性转化子的筛选 | 第48-49页 |
| 2.4 毕赤酵母的诱导表达 | 第49页 |
| 2.5 毕赤酵母的诱导表达的影响因素 | 第49-50页 |
| 2.5.1 木糖标准曲线的制定 | 第49页 |
| 2.5.2 木聚糖酶酶活的测定 | 第49-50页 |
| 2.5.3 产木聚糖酶酶活随温度的变化 | 第50页 |
| 2.5.4 产木聚糖酶酶活随pH值的变化 | 第50页 |
| 2.5.5 产木聚糖酶酶活随时间的变化 | 第50页 |
| 2.5.6 产木聚糖酶酶活随诱导物浓度的变化 | 第50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-56页 |
| 3.1 pPIC9K-XynA重组质粒线性化的图像 | 第50-51页 |
| 3.2 毕赤酵母电转化 | 第51页 |
| 3.3 阳性转化子的筛选 | 第51-52页 |
| 3.4 毕赤酵母木聚糖酶基因与大肠杆菌木聚糖酶的对比 | 第52-53页 |
| 3.5 毕赤酵母的诱导表达的影响因素 | 第53-56页 |
| 3.5.1 木糖标准曲线 | 第53-54页 |
| 3.5.2 产木聚糖酶酶活随温度的变化 | 第54页 |
| 3.5.3 产木聚糖酶酶活随pH值的变化 | 第54-55页 |
| 3.5.4 产木聚糖酶酶活随诱导时间的变化 | 第55页 |
| 3.5.5 产木聚糖酶酶活随诱导物浓度的变化 | 第55-56页 |
| 4 小结 | 第56-57页 |
| 第四章 木聚糖酶的纯化及其酶学性质的分析 | 第57-74页 |
| 1 实验材料 | 第57页 |
| 1.1 实验仪器 | 第57页 |
| 1.2 主要溶液 | 第57页 |
| 2 实验方法 | 第57-62页 |
| 2.1 毕赤酵母表达木聚糖酶纯化 | 第57-59页 |
| 2.1.1 采用硫酸铵逐级沉淀法提取粗酶 | 第57-58页 |
| 2.1.2 粗酶的透析处理 | 第58页 |
| 2.1.3 蛋白质标准曲线 | 第58页 |
| 2.1.4 DEAE Sephadex A-25弱阴离子交换柱层析 | 第58-59页 |
| 2.1.5 Sephadex G-75凝胶柱层析 | 第59页 |
| 2.1.6 重组蛋白的干燥 | 第59页 |
| 2.2 大肠杆菌表达木聚糖酶纯化 | 第59-60页 |
| 2.2.1 木聚糖酶在大肠杆菌中诱导表达 | 第59页 |
| 2.2.2 重组蛋白的预处理 | 第59页 |
| 2.2.3 重组蛋白的纯化和干燥 | 第59-60页 |
| 2.3 木聚糖酶的电泳 | 第60页 |
| 2.3.1 蛋白的制备 | 第60页 |
| 2.3.2 全菌粗蛋白SDS-PAGE | 第60页 |
| 2.4 酶学性质测定 | 第60-62页 |
| 2.4.1 酶的最适温度测定 | 第60-61页 |
| 2.4.2 酶的热稳定性研究 | 第61页 |
| 2.4.3 酶的最适pH测定 | 第61页 |
| 2.4.4 酶的pH稳定性研究 | 第61页 |
| 2.4.5 抑制剂和去污剂对酶活力的影响 | 第61页 |
| 2.4.6 金属离子对酶活力的影响 | 第61页 |
| 2.5.7 木聚糖酶米氏常数的测定 | 第61-62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-73页 |
| 3.1 硫酸铵分级沉淀各个阶段酶活 | 第62页 |
| 3.2 蛋白质标准曲线 | 第62-63页 |
| 3.3 木聚糖酶纯化 | 第63-65页 |
| 3.3.1 DEAE Sephadex A-25弱阴离子交换柱层析 | 第63-64页 |
| 3.3.2 Sephadex G-75凝胶柱层析 | 第64-65页 |
| 3.4 木聚糖酶的酶谱 | 第65-66页 |
| 3.5 热稳定木聚糖酶的酶学性质 | 第66-73页 |
| 3.5.1 木聚糖酶的最适温度 | 第66-67页 |
| 3.5.2 木聚糖酶的最适pH | 第67-68页 |
| 3.5.3 木聚糖酶温度耐受性 | 第68-69页 |
| 3.5.4 木聚糖酶pH耐受性 | 第69-70页 |
| 3.5.5 酶抑制剂或去污剂对木聚糖酶活性的影响 | 第70-71页 |
| 3.5.6 金属离子对木聚糖酶活性的研究 | 第71-72页 |
| 3.5.7 木聚糖酶的米氏常数 | 第72-73页 |
| 4 小结 | 第73-74页 |
| 第五章 结论与展望 | 第74-76页 |
| 1 结论 | 第74-75页 |
| 2 展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
