| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| 第一章 前言 | 第12-21页 |
| 1.1 常规基因组编辑手段 | 第12-13页 |
| 1.1.1 锌指核酸酶(ZFN) | 第12页 |
| 1.1.2 转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN) | 第12页 |
| 1.1.3 规律成簇的间隔短回文重复编辑/效应蛋白(CRISPR系统) | 第12-13页 |
| 1.2 CRISPR-Cas9系统 | 第13-19页 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas9原理 | 第13-17页 |
| 1.2.2 水稻CRISPR-Cas9编辑系统 | 第17-18页 |
| 1.2.3 Cas9变体蛋白VQR及VRER | 第18-19页 |
| 1.3 CRISPR-Cpf1系统 | 第19-20页 |
| 1.3.1 CRISPR-Cpf1原理 | 第19-20页 |
| 1.3.2 人类CRISPR-Cpf1编辑系统 | 第20页 |
| 1.4 本课题研究思路 | 第20-21页 |
| 第二章 拓展水稻基因组编辑范围的研究 | 第21-87页 |
| 2.1 实验材料与方法 | 第21-42页 |
| 2.1.1 敲除基因及靶位点选择 | 第21-24页 |
| 2.1.2 Cas9及Cpf1表达序列优化 | 第24页 |
| 2.1.3 Cas9变体蛋白创制 | 第24-27页 |
| 2.1.3.1 VQR的创制 | 第24-25页 |
| 2.1.3.2 VRER的创制 | 第25-27页 |
| 2.1.4 sgRNA改进 | 第27-28页 |
| 2.1.5 CRISPR系统基因敲除载体构建 | 第28-34页 |
| 2.1.5.1 CRISPR-Cas9 | 第28-32页 |
| 2.1.5.2 CRISPR-Cpf1 | 第32-34页 |
| 2.1.6 感受态制备及转化 | 第34-35页 |
| 2.1.6.1 大肠杆菌DH5α | 第34-35页 |
| 2.1.6.2 农杆菌EHA105 | 第35页 |
| 2.1.7 水稻原生质体细胞转化 | 第35-36页 |
| 2.1.8 农杆菌介导的水稻转基因 | 第36-37页 |
| 2.1.9 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取水稻DNA | 第37页 |
| 2.1.10 靶位点突变检测及分析 | 第37-40页 |
| 2.1.10.1 酶切法 | 第37-38页 |
| 2.1.10.2 Sanger测序 | 第38-39页 |
| 2.1.10.3 高通量测序 | 第39-40页 |
| 2.1.11 水稻基因组潜在靶位点数目分析 | 第40页 |
| 2.1.12 脱靶效应评估 | 第40-42页 |
| 2.2 结果与分析 | 第42-84页 |
| 2.2.1 水稻CRISPR-VQR/VRER编辑体系的建立 | 第42-52页 |
| 2.2.1.1 VQR成功编辑水稻基因 | 第42-46页 |
| 2.2.1.2 脱靶位点检测 | 第46-47页 |
| 2.2.1.3 VQR对NGA PAM的偏好性分析 | 第47-48页 |
| 2.2.1.4 VRER成功造成水稻基因突变 | 第48-52页 |
| 2.2.1.5 水稻基因组潜在可编辑位点分析 | 第52页 |
| 2.2.2 CRISPR-Cas9/VQR编辑系统优化 | 第52-60页 |
| 2.2.2.1 改进sgRNA | 第52-53页 |
| 2.2.2.2 改进后的sgRNA提高CRISPR-Cas9/VQR系统突变效率 | 第53-57页 |
| 2.2.2.3 水稻Ubi及Actin启动子提高CRISPR-VQR编辑系统效率 | 第57-59页 |
| 2.2.2.4 优化CRISPR-VQR编辑系统脱靶效应检测 | 第59-60页 |
| 2.2.3 野生型Cas9在水稻中高效识别NAG PAM | 第60-73页 |
| 2.2.3.1 Cas9意外产生NAG PAM靶位点突变 | 第60-61页 |
| 2.2.3.2 Cas9在水稻中高效识别NAG PAM | 第61-63页 |
| 2.2.3.3 NAG PAM具有更低的错配容忍度 | 第63-66页 |
| 2.2.3.4 Cas9在原生质体中对NAG PAM的编辑能力有限 | 第66-68页 |
| 2.2.3.5 CRISPR-Cas9体系在转基因水稻中高效编辑NAG PAM位点 | 第68-71页 |
| 2.2.3.6 PAM周遭序列对NAG PAM识别的影响 | 第71页 |
| 2.2.3.7 NGG和NAG PAM混合敲除模式 | 第71-72页 |
| 2.2.3.8 NAG PAM潜在可编辑位点分析 | 第72-73页 |
| 2.2.4 水稻CRISPR-Cpf1编辑体系的建立 | 第73-78页 |
| 2.2.4.1 tRNA间隔构建Cpf1多基因敲除系统 | 第73-74页 |
| 2.2.4.2 CRISPR-Cpf1成功编辑水稻基因组 | 第74-76页 |
| 2.2.4.3 crRNA3’端附加序列对基因编辑的影响 | 第76-77页 |
| 2.2.4.4 DNA突变类型及脱靶效应分析 | 第77-78页 |
| 2.2.5 CRISPR-Cpf1多基因编辑系统条件探索 | 第78-84页 |
| 2.2.5.1 TIP法构建Cpf1串联crRNA表达阵列 | 第78-80页 |
| 2.2.5.2 改进tRNA-crRNA系统在低效位点表现优于串联系统 | 第80-82页 |
| 2.2.5.3 串联系统在高效位点与改进tRNA-crRNA系统表现一致 | 第82-83页 |
| 2.2.5.4 全长DR序列与延长spacer序列对效率影响有限 | 第83-84页 |
| 2.3 讨论 | 第84-87页 |
| 第三章 研究展望与创新点 | 第87-88页 |
| 3.1 研究展望 | 第87页 |
| 3.2 本课题的创新点 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-93页 |
| 附录 | 第93-110页 |
| 致谢 | 第110-112页 |
| 作者简历 | 第112页 |
