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L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸

摘要第3-4页
Abstract第4-5页
第一章 绪论第9-16页
    1.1 β-丙氨酸第9-12页
        1.1.1 β-丙氨酸简介第9页
        1.1.2 β-丙氨酸的应用第9-10页
        1.1.3 β-丙氨酸的合成第10-12页
    1.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶第12-14页
        1.2.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶简介第12页
        1.2.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶催化机理第12-14页
        1.2.3 L-天冬氨酸α-脱羧酶的研究现状第14页
    1.3 本课题的立题和主要研究内容第14-16页
        1.3.1 立题依据第14-15页
        1.3.2 主要研究内容第15-16页
第二章 材料与方法第16-27页
    2.1 实验材料第16-20页
        2.1.1 主要实验试剂第16页
        2.1.2 菌株及质粒第16-17页
        2.1.3 引物设计第17-18页
        2.1.4 培养基及相关试剂的配制第18-20页
        2.1.5 主要实验仪器第20页
    2.2 实验方法第20-27页
        2.2.1 基因组DNA和相关质粒的提取第20-21页
        2.2.2 天冬氨酸α-脱羧酶基因的克隆第21页
        2.2.3 大肠杆菌感受态的制备及转化第21页
        2.2.4 目的基因的纯化和pMD18-T的连接第21-22页
        2.2.5 重组质粒的构建第22页
        2.2.6 枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化第22页
        2.2.7 谷氨酸棒状杆菌感受态的制备及电击转化第22-23页
        2.2.8 重组天冬氨酸α-脱羧酶菌株的诱导表达及细胞破碎第23页
        2.2.9 天冬氨酸α-脱羧酶的纯化及浓度测定第23-24页
        2.2.10 L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活的测定第24页
        2.2.11 L-天冬氨酸α-脱羧酶部分酶学性质的测定第24-25页
        2.2.12 重叠延伸PCR构建L-天冬氨酸α-脱羧酶突变株第25-26页
        2.2.13 突变的L-天冬氨酸α-脱羧酶催化稳定性及自我剪切的测定第26页
        2.2.14 全细胞转化生产β-丙氨酸的条件优化第26页
        2.2.15 重组L-天冬氨酸α-脱羧酶菌株的5L发酵罐培养和全细胞转化..第26-27页
第三章 结果与讨论第27-44页
    3.1 重组菌的克隆及表达第27-30页
        3.1.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶基因BsPanD、CgPanD和LpPanD的克隆及分析第27-28页
        3.1.2 大肠杆菌表达菌株的构建及表达第28页
        3.1.3 L-天冬氨酸α-脱羧酶的诱导表达及SDS-PAGE分析第28-29页
        3.1.4 重组E.coliBL21/pET28a-BsPanD菌株产β-丙氨酸的初步验证第29-30页
    3.2 重组酶的纯化及部分酶学性质分析第30-33页
        3.2.1 重组L-天冬氨酸α-脱羧酶的纯化及浓度测定第30-31页
        3.2.2 重组酶的最适反应温度和最适pH测定第31-32页
        3.2.3 重组L-天冬氨酸α-脱羧酶酶温度稳定性测定第32-33页
    3.3 枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的突变研究第33-40页
        3.3.1 不同来源天L-冬氨酸α-脱羧酶的序列对比及进化树分析第33-35页
        3.3.2 突变点的选择及突变株的构建第35-36页
        3.3.3 突变株的诱导表达及酶的纯化第36-37页
        3.3.4 突变株酶活的测定第37页
        3.3.5 突变点对天冬氨酸α-脱羧酶自我剪切的分析第37-38页
        3.3.6 突变株对酶的催化稳定的影响第38-40页
    3.4 重组菌的发酵及全细胞转化第40-44页
        3.4.1 转化温度对产β-丙氨酸的影响第40页
        3.4.2 转化缓冲液的pH对产β-丙氨酸的影响第40-41页
        3.4.3 底物Asp添加方式对产β-丙氨酸的影响第41-42页
        3.4.4 重组菌5L罐发酵及全细胞转化第42页
        3.4.5 三种重组菌株产β-丙氨酸能力差异分析第42-44页
主要结论与展望第44-45页
    主要结论第44页
    展望第44-45页
致谢第45-47页
参考文献第47-50页
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文第50页

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